清華大學陳國強教授、吳瓊副教授 Adv. Sci.: 以聚羥基脂肪酸酯為例探究細胞體積大小對工業(yè)生產(chǎn)的影響
大多數(shù)細菌只有1~2微米大，這樣微小的空間限制了胞內(nèi)產(chǎn)物（如聚羥基脂肪酸酯，PHA）的積累。細胞體積的大小主要受mreB、minCD等關鍵基因的調控，但改變這些基因的表達量對生長產(chǎn)生負面影響。因此，開發(fā)一種在不影響細胞生長的前提下增大細胞體積的方法顯得尤為重要。本研究通過改造細菌內(nèi)的ClpXP蛋白降解系統(tǒng)，實現(xiàn)對MreB蛋白的可控降解。在此基礎上，通過過表達PHA合成相關基因phaAB并敲除PHA顆粒表面蛋白PhaP1，成功實現(xiàn)了細胞體積的顯著增大（超過9倍）以及PHA產(chǎn)量的提升。在5噸發(fā)酵罐中，改造后的鹽單胞菌CYL0307在發(fā)酵44小時后，干重達到149g/L，PHA含量達到82%。
細菌的微小體積限制了胞內(nèi)產(chǎn)物的積累，然而對細胞骨架蛋白MreB以及分裂相關蛋白MinCD的調控對細菌生長造成負面影響。因此，需要開發(fā)一種在不影響細菌生長的前提下增大細胞體積的方法。本研究改造細菌內(nèi)的ClpXP蛋白降解系統(tǒng)并將其應用于MreB的可控降解，在此基礎上敲除PHA顆粒表面蛋白PhaP1同時過表達PHA合成相關基因phaAB，最終成功實現(xiàn)了細胞體積的顯著增大（九倍以上），PHA產(chǎn)量的提高和下游提取過程的簡化。
細菌內(nèi)有多種蛋白降解系統(tǒng)，其中研究最為廣泛的是ClpXP蛋白降解系統(tǒng)。在翻譯過程中，當?shù)鞍踪|在核糖體上發(fā)生停滯時，細菌內(nèi)的tmRNA（transfer-messenger RNA）會在停滯蛋白的C端加上SsrA標簽。該SsrA標簽可以與細菌內(nèi)的ClpXP蛋白酶特異性結合，從而促使停滯蛋白被降解。在本研究中，他們通過突變SsrA標簽的序列，調節(jié)其與ClpXP蛋白酶之間的相互作用強度，進而開發(fā)出一系列具有不同降解速率的突變標簽（圖1）。
圖1 突變后具有不同降解速率的標簽
在此基礎上，他們將突變后具有不同降解速率的SsrA標簽的DNA序列插入細菌基因組中mreB基因的終止密碼子前，使MreB蛋白在翻譯時就帶有SsrA標簽。鑒于MreB蛋白在維持細菌桿狀形態(tài)中的關鍵作用，通過調節(jié)其降解速率，他們期望能夠增加細菌寬度，獲得更接近球形的細菌。通過顯微鏡觀察，他們發(fā)現(xiàn)所有經(jīng)過基因編輯的細菌均呈現(xiàn)出更大的橢球狀形態(tài)，而對照菌株CYL0119則保持了較小的桿狀形態(tài)（圖2A）。進一步測試這些細菌的干重和PHA含量后發(fā)現(xiàn)，與對照菌株相比，經(jīng)過改造的工程菌株CYL0212的干重和PHA含量分別提高了14.2%和5%。（圖2B）。
圖2 降解MreB蛋白對細菌形態(tài)和PHA生產(chǎn)性能的影響
為了進一步增大細菌的體積，在CYL0212中過表達了minCD基因，MinCD蛋白與細胞分裂環(huán)的形成密切相關，其表達水平提高能抑制細胞分裂，使細胞變長。顯微鏡觀察結果顯示，過表達minCD確實進一步增大了橢球形細菌的體積（圖3A）。然而，在測量細胞干重和PHA含量后發(fā)現(xiàn)，這一操作顯著降低了細胞干重和PHA含量。因此，僅降解MreB的菌株被用于后續(xù)實驗（圖3B）。
圖3 通過過表達minCD進一步增大細胞體積，但降低干重和PHA含量
先前的研究表明，敲除PHA表面結合蛋白PhaP1會導致PHA顆粒發(fā)生融合，形成更大的顆粒，這有利于工業(yè)生產(chǎn)中的PHA提取過程。基于這一發(fā)現(xiàn)，他們在菌株CYL0212中敲除了phaP1基因，構建了工程菌株CYL0213，并利用透射電子顯微鏡對其內(nèi)部的PHA顆粒進行了觀察（圖4A）。結果表明，當phaP1基因被敲除后，PHA顆粒的直徑從0.63微米增加至1.67微米（圖4B）？紤]到橢球形細菌體積的增大為其提供了更多空間用于PHA積累，他們在CYL0213中過表達了PHA合成相關基因phaAB，構建了工程菌CYL0307，與對照菌株相比，CYL0307的細胞干重從17.2g/L提高至20.8g/L， PHA含量從73.3%提高至78.4%（圖4C）。
圖4 通過敲除phaP1和過表達phaAB優(yōu)化PHA的生產(chǎn)過程
接下來，他們將CYL0307用于7升、100升以及5噸發(fā)酵罐中進行PHA生產(chǎn)，以評估其在工業(yè)生產(chǎn)和提取過程中的性能表現(xiàn)。在PHA生產(chǎn)能力方面，結果顯示，工程菌CYL0307在不同規(guī)模發(fā)酵罐中的PHA產(chǎn)量均優(yōu)于對照菌株。特別是在5噸發(fā)酵罐中，經(jīng)過44小時發(fā)酵，CYL0307的細胞干重高達149g/L，PHA含量達到82%。而對照菌株在相同條件下干重僅為104g/L，PHA含量僅76%。在下游提取過程中，CYL0307也展現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢。首先，由于工程菌更大更重，其在發(fā)酵液中的沉降性能顯著增強，更易通過離心分離。在4000轉/分鐘的條件下，工程菌僅需離心4分鐘即可從發(fā)酵液中完全分離，而對照菌株則無法實現(xiàn)有效分離（圖5A）。其次，工程菌從桿狀轉變?yōu)榍驙睿毎诒谎诱，表面變得粗糙不平，這種結構變化說明細胞壁被破壞，從而可以更高效地提取胞內(nèi)PHA顆粒。與對照菌株相比，工程菌在破壁過程中溶菌酶使用量減少了28%（圖5B和5C）。此外，通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)酵結束后的菌株的形態(tài)，并計算其體積，結果顯示，CYL0307呈現(xiàn)出球狀結構，體積較對照菌株增大九倍以上（圖5D和5E）。
圖5 球形菌的下游提取優(yōu)勢
總結：本研究在非模式菌鹽單胞菌中開發(fā)了一種基于翻譯后修飾的蛋白質降解技術，實現(xiàn)了對目標蛋白MreB的可控降解。在此基礎上，通過敲除phaP1和過表達phaAB，成功使細菌體積增大九倍以上，并顯著提高了PHA的產(chǎn)量。此外，該技術還簡化了下游離心分離過程，并減少了溶菌酶的使用量，從而提升了PHA生產(chǎn)的效率和經(jīng)濟性。文章第一作者為清華大學生命科學學院博士生陳翊苓，文章通訊作者為清華大學生命科學學院陳國強教授和吳瓊副教授。
鏈接地址：https://doi.org/10.1002/advs.202412256
陳國強教授簡介
陳國強，1994年被聘為清華大學副教授，1997－今聘為清華大學教授，2003－2009年兼任汕頭大學多學科研究中心主任。長期從事“生物合成PHA材料及其下一代工業(yè)生物技術”的研究。學術論文在Google Scholar引用4萬多次，H指數(shù)105。獲得授權專利70多項，50個公開專利。開發(fā)的PHA技術已經(jīng)在數(shù)家公司用于大規(guī)模生產(chǎn)微生物塑料聚羥基脂肪酸酯PHA，使我國成為PHA領域國際上學術和產(chǎn)業(yè)最發(fā)達的國家、以及PHA醫(yī)學應用研究做多的國家，開發(fā)了多種PHA以及降解單體的多種應用。獲得的榮譽包括：國際生物聚合物（ISBP）工業(yè)獎（2024）；國際代謝工程獎（2023）、自然資源科學技術二等獎（2022）、全國先進科技工作者（2016）、候德傍化工創(chuàng)新獎（2015）、首屆閔恩澤能源化工杰出貢獻獎（2013）、談家禎生命科學創(chuàng)新獎（2011）、教育部長江學者特聘教授（2004）、教育部高校青年教師獎（2004）、第八屆中國青年科技獎（2003）、紐倫堡國際發(fā)明獎（2003）、茅以升科技獎（2003）、自然科學基金委國家杰出青年（2002）、 國家發(fā)明二等獎(排名第一)（2002）等。是973“合成生物學”項目以及國家重大專項項目的首席科學家、清華大學合成與系統(tǒng)生物學中心主任、英國曼徹斯特大學兼職講座教授。曾連續(xù)6年獲得清華大學學生“良師益友”的光榮稱號，進入清華大學“良師益友”名人堂。連續(xù)9年獲得清華大學高論文他引的“梅貽琦獎”。連續(xù)八年獲得Elsevier出版社生化與分子生物學高引用作者。學術服務：擔任國際期刊《Biotechnology Advances》和《Synthetic and Systems Biotechnology》主編，《生物工程學報》、《合成生物學》、《Journal of Biotechnology》 、《Microbial Cell Factories》、《Biotechnology Journal》和《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》副主編。另擔任國際學術期刊編委《Trends in Biotechnology》、《Current Opinions in Biotechnology》、《Metabolic Engineering》、《ACS Synthetic Biology》、《Microbial Biotechnology》、《Applied Microbiology and Biotechnology》、《Biomaterials》、《Biomacromolecules》和《Metabolic Engineering Communications》。
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