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  蛋白和多肽在生命體中具有重要生物學(xué)功能，但其實(shí)際應(yīng)用受到易被蛋白酶水解、體內(nèi)生物利用度低等缺點(diǎn)限制。多肽模擬研究可以針對性地解決多肽體內(nèi)穩(wěn)定性差的突出缺點(diǎn)對應(yīng)用的局限，因此在藥物發(fā)現(xiàn)、組織工程、蛋白模擬、生物材料和化學(xué)等諸多領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。多肽模擬物的降解可調(diào)使得多肽可以適配不同應(yīng)用場景，而多肽序列對其功能的發(fā)揮具有重要作用，因此，對酶降解可調(diào)和聚合物序列可控是多肽合成和應(yīng)用研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵性需求和挑戰(zhàn)。

  在多肽模擬研究領(lǐng)域中，劉潤輝教授課題組前期通過建立對水分不敏感的β-NTA（β-氨基酸N-硫代羧基酸酐）聚合新方法解決了β-內(nèi)酰胺聚合制備β-多肽的經(jīng)典合成方法對水分敏感、聚合條件苛刻、功能基團(tuán)適用性受限的核心挑戰(zhàn)（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 6412-6419）。本研究著眼于解決多肽模擬物對酶降解可調(diào)和聚合物序列可控的關(guān)鍵性需求和挑戰(zhàn)，通過α-NCA和β-NTA共聚實(shí)現(xiàn)了α/β-多肽的可控合成和對蛋白酶降解的調(diào)節(jié)；通過共聚反應(yīng)中溶劑對單體聚合速率的調(diào)節(jié)作用，實(shí)現(xiàn)了α/β-多肽的序列可控（圖1）。該研究成果以“Synthesis of Poly-α/β-peptides with Tunable Sequence Via the Copolymerization on N-carboxyanhydride and N-thiocarboxyanhydride”為題發(fā)表在iScience上（iScience. 2021, DOI:10.1016/j.isci.2021.103124）。

圖1：序列可調(diào)節(jié)的α/β-多肽合成

  首先以Boc-α-L-lys NCA和Bn-β³-LCHG NTA為代表性單體，研究不同溶劑對共聚反應(yīng)的影響，并展示在四氫呋喃溶劑中可控合成一系列不同鏈長（DP = 30-90）、低分散性（?=1.16-1.31）和不同氨基酸比例的α/β-肽。通過用側(cè)鏈不同功能化基團(tuán)的β-NTA單體和α-NCA共聚，展示該方法具有廣泛的底物適用性。

  作者提出并驗(yàn)證了伯胺引發(fā)α-NCA與β-NTA的共聚反應(yīng)機(jī)理為常規(guī)胺機(jī)理。該機(jī)理路線是通過引發(fā)劑伯胺親核加成到α-NCA或者β-NTA羰基，開環(huán)后脫去CO₂或COS小分子，生成末端為伯胺的活性中間體，重復(fù)上述步驟實(shí)現(xiàn)共聚反應(yīng)鏈增長。作者通過高分辨ESI表征引發(fā)劑：α-NCA：β-NTA為1：1：1混合物的質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物質(zhì)譜峰主要為末端伯胺的結(jié)構(gòu)；用MALDI-TOF-MS表征引發(fā)劑：α-NCA：β-NTA為1：15：15聚合反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)聚合得到的α/β-多肽C-端均含有引發(fā)劑基團(tuán)，從而支持了常規(guī)胺聚合機(jī)理。基于常規(guī)按機(jī)理，α-NCA與β-NTA的共聚反應(yīng)具有活性聚合特征，因此可成功實(shí)現(xiàn)多嵌段α/β-多肽合成以及α/β-多肽的雙端功能化。

  進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，α-NCA與β-NTA的共聚反應(yīng)動力學(xué)表現(xiàn)出顯著的溶劑驅(qū)動特性。在THF溶劑中，Boc-α-L-lys NCA具有比Bn-β³-LCHG NTA略高的競聚率，兩者的共聚反應(yīng)接近理想共聚，產(chǎn)物為無規(guī)共聚物形式的α/β-多肽。作者進(jìn)一步合成了模擬宿主防御肽的無規(guī)型聚α/β-多肽分子庫，通過摻入不同比例β-氨基酸可以調(diào)節(jié)α-多肽的抗菌活性。重要的是，β-氨基酸的無規(guī)摻入實(shí)現(xiàn)了對蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K23）降解的調(diào)節(jié)（圖2）。

圖2：在TFH中伯氨引發(fā)α-NCA與β-NTA的共聚反應(yīng)

  在CHCl₃/H₂O（95/5，v/v）的混合溶劑中，Boc-α-L-lys NCA和Bn-β³-LCHG NTA的競聚率差異增大24倍，這使得聚合產(chǎn)物為近似嵌段的α/β-多肽，GPC表征結(jié)果與理論分子量一致說明在含水混合溶劑中該共聚反應(yīng)仍然保持可控性。另外，在混合溶劑中兩種單體均聚動力學(xué)表明α-NCA可在5min完成聚合，此時聚合體系中β-NTA還剩余98%的未反應(yīng)（圖3）。

圖3：在CHCl₃/H₂O混合溶劑中伯氨引發(fā)α-NCA與β-NTA的共聚反應(yīng)

  基于溶劑對α-NCA與β-NTA共聚速率的調(diào)節(jié)作用，作者通過兩種方法實(shí)現(xiàn)了序列可調(diào)節(jié)的α/β-多肽合成。首先，以PEG-NH₂作為引發(fā)劑，將Boc-α-L-Lys NCA/Bn-β³-LCHG NTA混合物反復(fù)添加到聚合反應(yīng)中，可以得到具有交替Boc-α-L-Lys嵌段和Bn-β³-LCHG嵌段的十嵌段α/β-多肽。反應(yīng)液GPC表征結(jié)果證實(shí)這一方法得到多肽分子量與理論數(shù)值一致。然后，作者在PEG-NH₂引發(fā)β³-LCHG NTA聚合過程中將Boc-α-L-Lys NCA或α-BLG NCA交替添加到反應(yīng)液中, 基于α-NCA在該體系中具有遠(yuǎn)快于β-NTA單體的聚合速率，從而在β-多肽的相應(yīng)位置插入一段α-多肽（圖4）。

圖4：在CHCl₃/H₂O混合溶劑中序列可調(diào)的α-NCA與β-NTA共聚反應(yīng)

  多肽的序列控制對納米結(jié)構(gòu)具有重要影響�；谏鲜鲂蛄锌烧{(diào)的α-NCA與β-NTA共聚反應(yīng)通過一鍋法來制備三嵌段聚α/β-多肽具有極好的可重復(fù)性，以端基為PEG的三嵌段聚α/β-多肽PEG-poly(Boc-α-L-Lys)-b-poly(Bn-β³-LCHG)為例，六個不同批次的聚合反應(yīng)得到的產(chǎn)物GPC曲線幾乎完全重合。此外，通過該方法合成α/β-多肽可以通過調(diào)節(jié)β-氨基酸結(jié)構(gòu)來改變自組裝形貌，從而展現(xiàn)在多肽自組裝研究中的潛力（圖5）。

圖5：在CHCl₃/H₂O混合溶劑中一鍋法合成PEG功能化的三嵌段α/β-多肽自組裝

  本研究論文所建立的序列可控的α-NCA和β-NTA活性共聚方法，實(shí)現(xiàn)了合成具有酶降解可調(diào)和聚合物序列可控的α/β-多肽突破，為α/β-多肽的合成和功能研究打開了大門，對探索多肽大分子新折疊方式、自組裝結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能具有十分重要的意義。

  華東理工大學(xué)周敏博士是該論文的第一作者，劉潤輝教授是通訊作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金委等基金的資助。

  論文鏈接: https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(21)01092-0#relatedArticles