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  為了實現(xiàn)預(yù)防、診斷、治療等藥效功能，生物大分子藥物往往需要穿透細胞膜進入胞內(nèi)。因此，生物藥物胞內(nèi)遞送是生物藥物面臨的一個關(guān)鍵問題。由于光介導(dǎo)的胞內(nèi)遞送方法具有較好的通用性和調(diào)控性，適用于各類細胞和各種生物藥物的遞送，尤其是在體外或離體處理的情況，因此受到了越來越多的關(guān)注。比如，細胞治療往往需要將生物大分子藥物如核酸遞送到離體免疫細胞內(nèi)，以增強免疫應(yīng)答，提高治療效果。一般來說，飛秒脈沖激光束聚焦于細胞膜，在細胞膜上形成短暫的微小膜孔，外源物通過膜孔擴散進入胞內(nèi)，實現(xiàn)胞內(nèi)遞送。盡管飛秒激光介導(dǎo)的胞內(nèi)遞送已被證明了具有廣泛可行性，但將激光束精準聚焦到僅僅幾納米的細胞膜上是非常困難的，這會提升實驗操作的復(fù)雜性，降低胞內(nèi)遞送通量，從而極大限制了該方法的廣泛推廣和應(yīng)用。為了突破這一瓶頸，作者們利用陽離子聚合物對細胞膜具有通用黏附力的特點，將該聚合物修飾光敏納米粒，構(gòu)建了細胞富集的光響應(yīng)納米粒，顯著提高了生物大分子藥物小干擾核酸胞內(nèi)遞送效率和通量，增強了小干擾核酸在胞內(nèi)抑制蛋白表達的生物功能（ACS Nano，2014，8，6288–6296）。在此基礎(chǔ)上，光響應(yīng)納米粒進一步通過內(nèi)吞進入胞內(nèi)，被運輸?shù)郊毎烁浇�，形成細胞核富集；然后，再采用光輻照目標細胞，實現(xiàn)了可控生物大分子核內(nèi)遞送。與隨機細胞核破裂的傳統(tǒng)核內(nèi)遞送方法相比，該方法更加高效、可控（ACS Nano, 2018, 12, 7791?7802）。

  此外，傳統(tǒng)的選擇性胞內(nèi)遞送方法無法兼顧選擇精度和處理通量，比如，微注射方法精度高但通量低，而選擇性細胞電穿孔方法通量高但精度低。作者們利用光響應(yīng)納米粒的可控響應(yīng)特性，建立了快速、精準的光控輻照目標細胞的新方法，提高了一個數(shù)量級的細胞處理通量，同時還能達到單細胞選擇精度（J. Control. Release, 2017, 266, 198-204）。具體方法如下：通過光響應(yīng)納米粒與細胞共同孵育，在細胞膜上富集，并黏附在細胞膜上；然后，將需要遞送的大分子添加到細胞培養(yǎng)基中；最后，調(diào)控激光快速輻照選定的目標細胞，實現(xiàn)選擇性胞內(nèi)遞送，而其它未被選中的細胞不受影響（如圖1A）。圖1B左圖展示了將綠色熒光大分子選擇性胞內(nèi)遞送到愛因斯坦頭部區(qū)域的細胞，使得該部位的細胞呈現(xiàn)綠色熒光（注：黑色區(qū)域也有細胞，但非選擇區(qū)域，所以沒有顯示熒光特性）；通過重復(fù)光輻照程序，還可以將不同的大分子遞送到不同選擇的細胞內(nèi)，如圖1B右圖展示了依次遞送藍色、綠色、紅色熒光大分子到各自選定區(qū)域細胞。在此基礎(chǔ)上，為了突破光響應(yīng)納米粒胞內(nèi)遞送需要細胞在離體情況的瓶頸，近期作者們創(chuàng)新性地將光敏納米粒嵌合于透明高分子薄膜內(nèi)，制備了光響應(yīng)高分子薄膜，利用上述光控原理，實現(xiàn)了牛眼模型體內(nèi)高精度單細胞選擇性胞內(nèi)遞送或殺傷，增強了生物大分子藥物對腫瘤細胞的精準治療（Adv. Mater., 2021, DOI: 10.1002/adma.202008379）。

  根據(jù)最近市場調(diào)研報告（Transfection reagent and equipment market: Analysis & global forecast to 2025, www.marketsandmarkets.com），胞內(nèi)遞送科技市場擁有較大的市場價值。2019年全球關(guān)于胞內(nèi)遞送科技市場價值8.719億美元，從2020到2025將以7.7%年復(fù)率增長。作者們自主研發(fā)的光響應(yīng)納米粒胞內(nèi)遞送技術(shù)在比利時根特市TRinCE?公司做產(chǎn)品轉(zhuǎn)化，研制產(chǎn)品Lumipor?將投入市場。此外，鑒于在該研究領(lǐng)域的學(xué)術(shù)成績及聲譽，他們?yōu)閲H權(quán)威學(xué)術(shù)綜述期刊Chem. Soc. Rev. 撰寫了相關(guān)綜述論文（Chem. Soc. Rev.，2021，DOI：10.1039/C9CS00839J）。

圖1.光響應(yīng)納米粒細胞選擇性胞內(nèi)遞送。A. 細胞選擇性胞內(nèi)遞送技術(shù)原理。B. 光響應(yīng)納米粒的細胞選擇性胞內(nèi)遞送實驗結(jié)果圖，兩幅圖的標尺為1000 μm。

  但是，目前該方法遞送效率依賴于光敏納米粒與細胞緊密黏附，其潛在的毒副作用阻礙了該方法進一步向臨床應(yīng)用快速轉(zhuǎn)化。例如，在脈沖光作用下，光敏納米粒碎裂成只有幾納米的粒子殘留在細胞內(nèi)，可能導(dǎo)致細胞意外的基因突變。在細胞治療中，這一問題尤其值得關(guān)注，因為治療細胞的基因突變可能導(dǎo)致意外的毒副作用。因此，亟需構(gòu)建一種新的生物醫(yī)用光響應(yīng)材料，以避免細胞與光敏納米粒直接接觸，但同時又不妨礙光敏納米粒產(chǎn)生的光熱效應(yīng)增強細胞膜通透性，實現(xiàn)光敏納米粒與細胞非接觸的生物藥物安全、高效的胞內(nèi)遞送。

圖2.研究成果設(shè)計圖。

  針對上述難點，他們在生物醫(yī)用光響應(yīng)納米纖維的構(gòu)建及其生物大分子藥物胞內(nèi)遞送的應(yīng)用開展了基礎(chǔ)、系統(tǒng)、深入的研究（如圖2和圖3a）。主要研究內(nèi)容包括：

• （1）研究了光敏納米粒嵌合的納米纖維結(jié)構(gòu)與胞內(nèi)遞送效率的構(gòu)效關(guān)系；重點關(guān)注靜電紡絲制備參數(shù)，控制嵌合光敏納米粒與纖維表面接觸的細胞距離，以保證嵌合光敏納米粒生成的光熱效應(yīng)能有效增強細胞膜通透性，得到最優(yōu)光響應(yīng)納米纖維結(jié)構(gòu)，用于生物大分子藥物胞內(nèi)遞送；

• （2）進一步，研究了光響應(yīng)納米粒生成的光熱效應(yīng)與細胞膜作用機理；主要關(guān)注光輻照光敏納米粒生成光熱效應(yīng)的過程，及其作用于細胞膜增強細胞膜滲透性的機制；

• （3）應(yīng)用小鼠模型，采用最優(yōu)光響應(yīng)納米纖維遞送生物高分子藥物小干擾核酸到人體免疫T細胞內(nèi)，以形抑制PD-1蛋白的表達，從而提供治療T細胞（CAR-T細胞）抑制腫瘤增長，最終達到增強治療效果的目的。

  主要實驗原理如下：如圖3a左上圖所示，在光輻照前，細胞黏附在光敏納米粒嵌合的納米纖維上；當光輻照納米纖維負載的光敏納米粒，激發(fā)光敏納米粒產(chǎn)生光熱效應(yīng)作用于細胞膜（圖3a左中圖）；合理的納米粒嵌合度保證了光熱效應(yīng)能有效作用于細胞膜，增強其通透性，但又不與細胞直接緊密接觸（圖3a右上圖）；分散在胞外的生物大分子藥物通過局部通透的細胞膜擴散進入胞內(nèi)，實現(xiàn)安全高效生物大分子藥物胞內(nèi)遞送（圖3a左下圖）；主要取得如下研究成果。

1. 光熱納米纖維的制備與表征。

  光熱納米纖維由聚合物（PCL）和氧化鐵納米粒（IONP）的混合物電紡制備而得。掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果顯示：在不同納米粒的濃度，納米纖維的平均直徑約為300 nm (圖3b-d)。通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，靜電紡絲1 h后，纖維膜的厚度逐漸增加到4 μm (圖3e, f)。當添加IONPs時，纖維膜的厚度沒有明顯變化(圖3g)。當IONP含量從0.02%增加到5%時，氧化鐵納米粒面積密度從1.7團簇/1000μm2線性增加到192團簇/1000μm2(圖3i)。進一步，通過定義三個參量，分析了IONPs在納米纖維中的分布情況(圖3j-m)。

圖3.光熱納米纖維胞內(nèi)遞送概念及光熱納米纖維的表征。(a)光熱納米纖維的胞內(nèi)遞送原理示意圖。(b)含有0和1 wt%光響應(yīng)納米粒的納米纖維的SEM和TEM圖像。(c)不含納米粒的納米纖維直徑分布圖。(d)含不同納米粒(0 - 5%)的納米纖維直徑。(e)納米纖維(不含納米粒)的共聚焦顯微鏡圖像。(f)纖維膜厚度隨著靜電紡絲時間的變化。(g)30 min紡絲后，納米纖維膜厚度與含納米粒的關(guān)系。(h)20 kV的SEM成像清楚地顯示了納米粒在纖維內(nèi)部(下)，而在1.5 kV較低電壓下則不是這樣。(i)單位面積的納米粒團簇與納米粒含量的關(guān)系。(j-m)納米粒在納米纖維中的分布示意圖以及相應(yīng)結(jié)果。

2. 光熱納米纖維高效、安全的大分子胞內(nèi)傳遞。

  首先，光熱納米纖維被證明能高效、安全遞送大分子到HeLa貼壁細胞。通過共聚焦顯微鏡圖像結(jié)果定量分析，得到增加激光能量密度或納米粒的含量能提高遞送效率，但細胞毒性也逐漸增加；發(fā)現(xiàn)當激光能量密度為0.08 J/cm² 和納米粒含量為1%時，得到最優(yōu)胞內(nèi)遞送結(jié)果（圖4a）。接下來，測試了光熱納米纖維對Jurkat懸浮細胞的遞送效率。發(fā)現(xiàn)當激光能量密度為0.16 J/cm²和納米粒含量為2%時，得到最優(yōu)胞內(nèi)遞送結(jié)果（圖4b）。最后，質(zhì)譜檢測結(jié)果表明包裹在納米纖維中的納米粒沒有泄露到溶液或細胞（圖4c-f）。

圖4.光熱納米纖維高效、安全的大分子胞內(nèi)傳遞。(a)紅色熒光標記的10 kDa葡聚糖(RD10)的HeLa貼壁細胞遞送效率、存活率與激光能量密度、光敏納米粒含量的關(guān)系。(b)Jurkat懸浮細胞遞送效率、存活率與激光能量密度、光敏納米粒含量的關(guān)系。(c-d)光照射后ICP-MS/MS測定細胞中Fe含量的實驗示意圖；不同實驗條件下，F(xiàn)e含量的測量結(jié)果。(e-f)光照射后ICP-MS/MS測定水溶液中Fe含量的實驗步驟示意圖，以及不同實驗條件下的Fe含量的測量結(jié)果。

3. 局部瞬態(tài)熱效應(yīng)是光熱納米纖維增強細胞膜通透性的主要原因。

  實驗結(jié)果證明了光化學(xué)反應(yīng)如活性氧(ROS)的產(chǎn)生不是增強細胞膜通透性的主因，因為該項研究中使用的脈沖寬度(7 ns)不太可能引起光化學(xué)反應(yīng)使得細胞膜通透性增強（一般，光化學(xué)反應(yīng)采用超快飛秒脈沖激光與光敏納米粒作用產(chǎn)生）。這也意味著光熱機制是導(dǎo)致細胞膜通透性的主要原因。而光熱機制通常有兩種形式：納米氣泡造成的局部細胞膜穿孔，或者通過熱傳遞導(dǎo)致細胞膜通透性增強。實驗結(jié)果表明：納米氣泡生成需要當前采用最高的激光能量密度的數(shù)十倍之高，因此也可以排除納米氣泡造成細胞膜穿孔作為主要機制。通過上述排除法，證實了熱傳遞是細胞膜通透性增強的主要機制。其過程是納米纖維內(nèi)的光敏納米粒簇在脈沖光作用下，局部溫度迅速升高，使得細胞與納米纖維接觸的局部細胞膜通透性增強（圖5a）。最后，理論數(shù)值模擬了脈沖激光照射光敏納米粒后的熱傳遞過程以及主要影響參數(shù)（圖5b-j）。

圖5.局部瞬態(tài)熱效應(yīng)是光熱納米纖維致細胞膜通透的主要原因。(a)激光誘導(dǎo)光熱納米纖維產(chǎn)生熱效應(yīng)及熱傳遞示意圖。(b)采用紫外-可見光譜法測量得到160 nm光敏納米粒的消光光譜以及根據(jù)Mie理論計算結(jié)果。(c)光敏納米粒在647 nm吸收7 ns脈沖激光溫度升高的計算結(jié)果。(d)0.08 J/cm2激光能量密度照射下誘導(dǎo)光熱納米纖維產(chǎn)生熱效應(yīng)及其熱傳遞的結(jié)果。(e-f)平均溫度和有效熱效應(yīng)面積隨著時間的變化。(g-j)平均溫度和有效熱效應(yīng)面積在不同納米粒聚合情況隨著激光能量密度的變化。

4. 光熱納米纖維應(yīng)用于生物大分子siRNA或CRISPR/Cas9的胞內(nèi)遞送研究。

  成功實現(xiàn)模型大分子胞內(nèi)遞送后，光熱納米纖維進一步被應(yīng)用于生物功能大分子siRNA或CRISPR/Cas9的胞內(nèi)遞送。首先，光熱納米纖維將抗綠色熒光蛋白(GFP)的siRNA遞送到穩(wěn)定表達GFP的H1299細胞中。研究結(jié)果表明隨著siRNA濃度(0.5, 1, 2和5μM)的增加，GFP的靜默效率越高，同時不影響細胞活性（圖5a-f）。接著，光熱納米纖維將敲除GFP表達的RNPs遞送到H1299細胞中。研究結(jié)果表明GFP的敲除效率隨著RNP濃度的增加而增加，最高RNP濃度的GFP敲除效率可達80%（圖5g-j）。

圖6.光熱納米纖維應(yīng)用于生物大分子siRNA或CRISPR/Cas9 RNPs的胞內(nèi)遞送研究。(a)光熱納米纖維將siRNA或RNPs遞送到H1299細胞以抑制或敲除綠色熒光蛋白（GFP）表達的實驗示意圖。(b)共聚焦顯微鏡圖像顯示了對照和siRNA胞內(nèi)遞送的H1299細胞GFP的表達。(c)相應(yīng)的流式細胞儀直方圖結(jié)果。(d-f)24小時后H1299細胞在不同情況下的GFP表達和活性結(jié)果。(g-h)光熱納米纖維將RNPs遞送到H1299細胞以敲除GFP表達；共聚焦顯微鏡圖像和相應(yīng)的流式細胞儀結(jié)果。(i-j) 48小時后H1299細胞在不同情況下的GFP敲除和活性結(jié)果。

5. 光熱納米纖維應(yīng)用于人胚胎干細胞(hESC)高效安全的生物大分子胞內(nèi)遞送。

  在該工作中，光熱納米纖維還被應(yīng)用于細胞治療相關(guān)的人胚胎干細胞（hESCs）的胞內(nèi)遞送。實驗結(jié)果表明隨著遞送效率逐漸提高，但同時細胞活性也降低了；當I=0.08 J/cm²時，獲得最優(yōu)遞送效率為63%；與此相比，傳統(tǒng)電穿孔方法在最優(yōu)程序(CE-118)的遞送率僅為25%（圖7a-d）。同時，研究結(jié)果表明光熱納米纖維處理后的人胚胎干細胞不影響干細胞功能特性（圖7e-i）。最后，光熱納米纖維成功的應(yīng)用到遞送RNPs到hESCs細胞，以敲除X染色體上的IL-2Rgamma (IL-2R)基因表達（圖7j-k）。

圖7.光熱納米纖維應(yīng)用于人胚胎干細胞(hESC)高效安全的生物大分子胞內(nèi)遞送。(a)不同實驗條件下，hESC胞內(nèi)遞送效率和細胞活性。(b)不同電穿孔條件下的hESC遞送效率和細胞活性。(c)共聚焦顯微鏡圖像顯示了hESC遞送效率和細胞活性。(d)在最優(yōu)光熱納米纖維和電穿孔實驗條件下處理hESC后，24 h后兩者細胞存活率和遞送效率。(e)最優(yōu)實驗條件下處理hESC后，細胞生長效率。(f)光熱納米纖維處理hESCs 24小時后，轉(zhuǎn)錄因子Oct4 (Pou5f1)、Sox2和Nanog免疫染色共聚焦顯微鏡圖像。(g)Oct4 (Pou5f1)、Sox2和Nanog轉(zhuǎn)錄因子的量化結(jié)果。(h)標記特異蛋白TNNT2和NKX2.5的免疫染色共聚焦圖像展示了hESCs分化為心肌細胞。(i)心肌細胞TNNT2和NKX2.5的量化結(jié)果。(j)hESCs在不同實驗情況下的Sanger基因序列。(k)通過Sanger測序分析了IL-2R敲除效率。

6. 光熱納米纖維應(yīng)用于人T細胞高效安全的生物大分子胞內(nèi)遞送。

  最后，光熱納米纖維被應(yīng)用于人供體來源的T細胞的胞內(nèi)遞送。研究發(fā)現(xiàn)光熱納米纖維的最佳遞送效率為40.7%，而傳統(tǒng)電穿孔方法為19.3%，盡管在遞送siRNA以抗PD-1蛋白表達效率類似（圖8a-d）。為保證遞送安全性，遞送方法應(yīng)該最小限度地干擾治療細胞的功能特性。結(jié)果表明光熱納米纖維對T細胞形態(tài)、表型、激活狀態(tài)的功能沒有顯著影響，而以此相反的是電穿孔對T細胞功能影響較大（圖8e-f）。最終導(dǎo)致了電穿孔處理的T細胞在目標細胞殺傷功能減弱，而光熱納米纖維處理的T細胞能保持原有功能特性（圖8i-j，圖9）。

圖8.光熱納米纖維應(yīng)用于人T細胞高效安全的生物大分子胞內(nèi)遞送。(a)光熱納米纖維應(yīng)用于T細胞遞送。(b)電穿孔后的T細胞遞送。(c-d)光熱納米纖維和電穿孔方法遞送小干擾核酸siPD1到T細胞以抑制PD1蛋白表達。(e)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞1小時后，對細胞尺寸的影響。(f)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，相對鈣離子隨時間的變化。(g)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，幾種關(guān)鍵促炎或抗炎細胞因子的分泌情況。(h)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，激活標記物CD137、CD154以及PD1的蛋白表達情況。(i)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，細胞的增殖情況。(j)光熱納米纖維和電穿孔方法處理T細胞后，細胞在體外對目標細胞殺傷情況。

圖9.光熱納米纖維處理后的T細胞在體內(nèi)保持著細胞功能特性。(a)光熱納米纖維將siRNA遞送到CAR-T細胞以證明在SKOV3腫瘤小鼠模型有效性的實驗示意圖。(b)靜脈注射CAR-T細胞(陰性對照，n=5)、光熱納米纖維將siPD1遞送到CAR-T細胞(實驗組，n=4)、CAR-T細胞聯(lián)合PD1-抗體給藥(陽性對照，n=4)的腫瘤大小隨時間變化。

總之，該工作開發(fā)了一種新型的生物大分子胞內(nèi)遞送方法，其不僅保持了光敏納米粒在光響應(yīng)胞內(nèi)遞送的主要優(yōu)點，同時避免了其致命缺點，即光敏納米粒殘留在細胞內(nèi)產(chǎn)生潛在的毒副作用。通過優(yōu)化光敏納米粒在納米纖維的嵌合度，以控制作用于細胞的光熱效應(yīng)，創(chuàng)造性地將光響應(yīng)納米粒胞內(nèi)遞送與靜電紡絲技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了納米粒與細胞非接觸的生物大分子藥物安全高效的胞內(nèi)遞送，增強生物大分子藥物藥效，有望進一步提高疾病治療效果。

  近日，該研究成果以“Photothermal nanofibers enable safe engineering of therapeutic cells”為題在學(xué)術(shù)期刊Nature Nanotechnology（譯名《自然納米技術(shù)》）上在線發(fā)表。中比先進生物醫(yī)用材料國際聯(lián)合實驗室（南京林業(yè)大學(xué)-根特大學(xué)）熊燃華教授為該論文的第一作者和通訊作者，黃超伯教授、Stefaan C. De Smedt院士和Kevin Braeckmans教授為共同通訊作者。該成果得到了國家自然科學(xué)基金項目、南京林業(yè)大學(xué)標志性成果培育項目等資助。

  全文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41565-021-00976-3 

  實驗室主頁：https://www.x-mol.com/groups/nfu-ugent

  下載：Photothermal nanofibers enable safe engineering of therapeutic cells