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UCL宋文輝教授和KCL Lieberam教授 AM: 生物基彈性體納米纖維引導(dǎo)光基因控制的人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞衍生骨骼肌纖維
2022-03-18  來(lái)源：高分子科技

  骨骼肌通過(guò)肌腱附著在人體的骨骼上，并產(chǎn)生身體各個(gè)部位的運(yùn)動(dòng)，比如走路和呼吸。骨骼肌的功能可能會(huì)受到肌肉疾病和神經(jīng)肌肉疾病的影響，例如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥。目前科學(xué)家們使用實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞來(lái)研究這些疾病的病理，并培養(yǎng)相關(guān)疾病模型用于新藥設(shè)計(jì)篩選。然而骨骼肌組織由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和高強(qiáng)度的收縮性質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中是很難完全復(fù)制培養(yǎng)的。在人體中，肌纖維的骨骼肌細(xì)胞是被細(xì)胞外基質(zhì)支撐包圍著， 并引導(dǎo)人體內(nèi)骨骼肌組織結(jié)構(gòu)的排列、生長(zhǎng)和功能。如果沒(méi)有類似的支撐結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的肌肉是無(wú)法達(dá)到研究肌肉疾病所需的更接近人體的肌肉。目前文獻(xiàn)報(bào)道的肌肉培養(yǎng)方法還受限于復(fù)雜耗時(shí)的高成本制造步驟和測(cè)試方法。


  近日，倫敦大學(xué)學(xué)院外科重建與再生生物材料中心主任宋文輝教授和倫敦國(guó)王學(xué)院基因治療和再生醫(yī)學(xué)中心Lieberam 教授在《Advanced Materials》期刊上發(fā)表了題為” Biobased Elastomer Nanofibers Guide Light-controlled Human iPSC-derived Skeletal Myofibers”( DIO：10.1002/adma.202110441) 。為了解決這個(gè)問(wèn)題，兩個(gè)團(tuán)隊(duì)結(jié)合在生物高分子材料和干細(xì)胞技術(shù)的專長(zhǎng)，合作開(kāi)發(fā)了一種新型生物基高彈性納米纖維生物材料支架和便捷靈敏的骨骼肌纖維培養(yǎng)多孔板盤(pán)， 利用光基因控制的人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPSC）在納米纖維支架上衍生出更接近人體的骨骼肌纖維，證實(shí)了納米纖維支架有助于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的骨骼肌組織的生長(zhǎng)和穩(wěn)定。

 

  實(shí)驗(yàn)先設(shè)計(jì)合成了生物基聚氨酯彈性體，其納米纖維是使用靜電紡絲技術(shù)制成， 并通過(guò)附加電場(chǎng)來(lái)引導(dǎo)納米纖維排列取向。 該納米混雜彈性材料具有優(yōu)異的高彈性，其斷裂應(yīng)變高達(dá)1000%，彈性模量（~25kPa）在人體骨骼肌的（~11-50kPa）模量范圍內(nèi)。 匹配的高彈性特性及像細(xì)胞外基質(zhì)形貌的納米纖維結(jié)構(gòu)使其成為支撐肌纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和收縮的理想支架。肌纖維細(xì)胞是從人類iPSC干細(xì)胞分化衍生出來(lái)的。iPSC干細(xì)胞是一種由成人皮膚細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子等技術(shù)脫分化形成的多能干細(xì)胞, 這類干細(xì)胞具有類似胚胎干細(xì)胞那樣的再生能力，理論上可以分化為成體的所有器官和組織。 這些干細(xì)胞經(jīng)過(guò)光基因工程處理， 使其分化衍生的肌纖維細(xì)胞對(duì)光響應(yīng)。這使得我們能夠通過(guò)光波信號(hào)控制肌纖維收縮，并在自制的懸浮彈性納米纖維多孔板盤(pán)培養(yǎng)皿中研究肌肉收縮功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，單軸排列取向的彈性納米纖維能引導(dǎo)成肌纖維細(xì)胞定向生長(zhǎng)， 促進(jìn)和加強(qiáng)肌細(xì)胞纖維的生成。藍(lán)光刺激時(shí)，彈性納米纖維引導(dǎo)的骨骼肌纖維的收縮速度和收縮力分別高于是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的200% 和280%， 其收縮能量密度為~35 W/m3 , 也在人體骨骼肌的收縮能量密度范圍類。

 

  彈性納米纖維支架孔板盤(pán)適用于各種通用型和高通量的測(cè)試和圖像分析表征方法， 可以同時(shí)進(jìn)行大量樣品試驗(yàn)。這將為肌肉和神經(jīng)肌肉疾病建模，病理研究和治療肌肉疾病的新藥物篩選提供便捷的技術(shù)平臺(tái)。另外，生物基聚氨酯彈性體具有很好的生物相容性和生物降解性，有望用于組織工程支架促進(jìn)生成代替肌肉組織治療骨骼肌損傷患者。

 

圖1. (a) 電紡納米纖維支架引導(dǎo)光基因控制的人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPSC）衍生骨骼肌纖維生長(zhǎng)示意圖；(b) 生物基聚氨酯彈性體分子結(jié)構(gòu) 



圖2聚氨酯彈性體,P(EDS)UU-POSS, 納米纖維的結(jié)構(gòu)和性能。(a) EDS 多元醇、POSS 納米結(jié)構(gòu)、P(EDS)U-POSS 聚合物及其納米纖維的紅外光譜（FTIR）； (b) 隨機(jī)取向和單軸取向的納米纖維的偏振FTIR 光譜。紅外線束在平行于（0°）和垂直于（90°）排列的纖維方向上進(jìn)行偏振；(c) 隨機(jī)取向和單軸排列的納米纖維的掃描電子顯微鏡（ SEM）形貌圖像；(d) 從SEM 圖像測(cè)量的納米纖維直徑分布； (e) 快速傅里葉變換(FFT)分析 SEM 圖像測(cè)量和擬合纖維取向分布；(f) 納米纖維結(jié)構(gòu)的高度和相位的原子力顯微鏡（ AFM）圖像；(g) 和（h）隨機(jī)和 取向的納米纖維支架的拉伸斷裂面SEM 圖像。(i) 拉伸應(yīng)力- 應(yīng)變曲線；(j) 不同應(yīng)變區(qū)的熵彈性模量；(k) 聚合物澆鑄固體、隨機(jī)取向和單軸對(duì)齊納米纖維支架的拉伸強(qiáng)度、韌性和斷裂應(yīng)變。

 


圖3. 肌纖維細(xì)胞在彈性納米纖維支架上的形態(tài)和分化的熒光顯微鏡圖像。藍(lán)色代表細(xì)胞核DNA；綠色代表肌肉細(xì)胞中表達(dá)的F-肌動(dòng)蛋白。C2C12 肌細(xì)胞在（a）玻璃蓋玻片（對(duì)照）;（b）隨機(jī)定向 和（c）單項(xiàng)排列的彈性納米纖維上第 1、5 和 10 天的生長(zhǎng)分化成肌管；(d) 快速傅里葉變換（FFT）分析肌纖維細(xì)胞和肌管的方向性。(e)和（f） 第 10 天肌管長(zhǎng)度和寬度的頻率分布。(g) 第 10 天肌管融合指數(shù)（MFI）和（h）肌管成熟指數(shù)（MMI）。比例尺100μm。

 


圖 4. 單軸取向的懸浮納米纖維支架（SNFs）的組裝。(1) 直徑 6.96 毫米的微孔從 2 毫米厚的涂有雙面膠的亞克力板上切割下來(lái)。(2) 單個(gè)微孔被放置在兩個(gè)帶電的電極之間， 膠面朝上。對(duì)齊的納米纖維被電紡在微孔上。(3) 微孔和納米纖維懸浮在一側(cè)，被倒置，并固定在一個(gè) 35 毫米的組織培養(yǎng)皿的底部。膠帶的作用是將納米纖維固定在微孔的邊緣，同時(shí)允許將微孔固定在培養(yǎng)皿上。(4) 對(duì)組裝好的微孔進(jìn)行空氣等離子體處理和紫外線消毒，以去除表面污染。(5) 在細(xì)胞播種前，用 GFR-Matrigel 預(yù)涂 SNFs。在濃縮的（30k 細(xì)胞/100ul）培養(yǎng)基中，將成肌祖細(xì)胞直接播種到中心孔中。5 分鐘后，一旦細(xì)胞明顯沉淀到孔底，就在組織培養(yǎng)皿中加入 1.5ml 的培養(yǎng)基。

 


圖 5. 光基因控制人類 iPSC 衍生的肌纖維。(a) 第 0-21 天從人類iPSCs 到成肌細(xì)胞祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化（progenitor differentiation [pd]，day 0pd-21pd ）；第0-8天從祖細(xì)胞到肌管分化（myotube differentiation [md]， day 0md-8md），以及第8-20天肌管成熟為肌纖維 (day 8md-20md)；(b) 表達(dá) PAX7、MYOD1 和 MYOG 的成肌細(xì)胞祖細(xì)胞（day 21pd）和肌管（day 8md）的熒光（ICC）圖像分析；(c) 第 10 天肌管（day 10md）紋狀肉質(zhì)Titin(TTN)的表達(dá)；(d) 第 10 天 肌管（day 10md）中轉(zhuǎn)基因 ChR2-YFP 的表達(dá)。 



圖 6. 懸浮納米纖維引導(dǎo)人類 iPSC 衍生的肌纖維的光遺傳控制收縮。(a) 在組織培養(yǎng)（TC）塑料（對(duì)照）和懸浮納米纖維支架（SNFs）上培養(yǎng)的人類 iPSC 衍生的肌纖維的顯微鏡白場(chǎng)圖像；(b) 第 14 天培養(yǎng)物的 3D 和 2D 肌纖維細(xì)胞的 F-肌動(dòng)蛋白和肌原蛋白（MYOG）免疫熒光圖像；(c) 粒子圖像測(cè)速儀（PIV）分析光遺傳控制的收縮位移矢量圖和收縮速度分布熱圖；(d) 第 20 天對(duì)照組和 納米纖維支架上的肌纖維收縮的PIV 視頻中得到的肌纖維收縮速度（CV）軌跡。圖中的藍(lán)色區(qū)域表示 470nm 光開(kāi)啟的 0.5s 時(shí)間窗口。平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；(e) 第 8 天到第 20 天的對(duì)照組和 取向納米纖維支架上的肌纖維的面積平均收縮速度(μm/s)；（f）比收縮力（kN/m2 ) 和 (g) 能量密度（ W m-3 )；(h) 第 20 天的 收縮速度和比收縮力相對(duì)于對(duì)照組的百分比差異；(i) SNFs 上培養(yǎng)的肌纖維的掃描電子顯微鏡（ SEM）圖像。

 

  論文第一作者是博士生 Aimee Cheesbrough。通訊作者為宋文輝教授和Lieberam 教授。此研究得到BBSRC 倫敦跨學(xué)科博士 ( LIDo )培訓(xùn)計(jì)劃， EPSRC和 MRC基金及 Wellcome Trust慈善基金等支持。

 

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202110441

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