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  不可控制的大規(guī)模動(dòng)脈出血在戰(zhàn)場(chǎng)、緊急情況以及臨床環(huán)境中構(gòu)成了重大的致命風(fēng)險(xiǎn)，全球30%以上的創(chuàng)傷性死亡是由過(guò)度失血引起的。目前，手術(shù)縫合、紗布敷料、電凝可通過(guò)收緊傷口、用力按壓或凝固電流，封閉創(chuàng)面出血部位、發(fā)揮止血作用，是臨床手術(shù)常用的止血方法。由于止血效率有限、技術(shù)操作繁瑣、炎癥反應(yīng)嚴(yán)重、繼發(fā)性組織損傷，僅適用于靜脈出血的情況。嚴(yán)重創(chuàng)傷引起的出血控制仍然是全球臨床和日常生活中的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。雖然，近年來(lái)發(fā)展的止血材料已經(jīng)能夠終止大規(guī)模動(dòng)脈出血，但一些主要的缺點(diǎn)包括施加紫外輻射、按壓以及使用過(guò)程中釋放熱能的必要性嚴(yán)重限制了它們的臨床應(yīng)用，特別是對(duì)于深、不規(guī)則形狀的傷口。

  鑒于此，福州大學(xué)食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊黃浩教授課題組成員張進(jìn)教授基于貽貝和藤壺水泥蛋白的粘附機(jī)制，開發(fā)了一種具有可重復(fù)、優(yōu)異持久粘附性以及多模式自愈合性的新型雙仿生水凝膠（C-CTS/SA-Ag-dECM），并用于心臟/大動(dòng)脈止血。由于具有豐富的酚羥基、界面水的去除能力并協(xié)同酚-醌的動(dòng)態(tài)氧化還原平衡反應(yīng)，雙仿生多網(wǎng)絡(luò)水凝膠表現(xiàn)出超高的濕組織粘附性能。體外實(shí)驗(yàn)證明，C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠具有良好的抗菌性能和生物相容性，進(jìn)一步應(yīng)用于兔/豬的多種器官出血模型。與商業(yè)紗布相比，水凝膠由于其強(qiáng)大的傷口封閉能力和激活止血屏障膜的協(xié)同作用在所有兔/豬創(chuàng)傷出血模型中均表現(xiàn)出優(yōu)異的止血能力。這些結(jié)果表明，具有多功能特性的雙仿生止血水凝膠，為未來(lái)急性創(chuàng)傷出血的緊急治療提供了重要的應(yīng)用價(jià)值。該研究以題為“Mussel- and Barnacle Cement Proteins-Inspired Dual-Bionic Bioadhesive with Repeatable Wet-Tissue Adhesion, Multimodal Self-Healing, and Antibacterial Capability for Nonpressing Hemostasis and Promoted Wound Healing”的論文發(fā)表在國(guó)際頂尖期刊《Advanced Functional Materials》上。

【C-CTS/SA-Ag/dECM雙仿生止血水凝膠的制備機(jī)理與結(jié)構(gòu)特性】

  研究人員受貽貝和藤壺水泥蛋白粘附機(jī)制的啟發(fā)，制備了由氫鍵、靜電相互作用和陽(yáng)離子-π鍵結(jié)合的雙仿生多鏈網(wǎng)絡(luò)粘合劑（圖1）。鄰苯二酚基團(tuán)改性殼聚糖（C-CHI）的內(nèi)源性止血與單寧酸（TA）的傷口封閉功能相結(jié)合，不僅促進(jìn)紅細(xì)胞聚集從而實(shí)現(xiàn)快速止血，還很好的模擬了貽貝足蛋白（Mfp）側(cè)鏈的提取物（L-3,4二羥基苯丙氨酸，L-DOPA），充分提高粘合劑的濕粘附性。含有大量陽(yáng)離子賴氨酸(Lys)和氨基酸的藤壺水泥蛋白（CP19K）是藤壺水泥-底物邊界的主要組成部分，其中的蛋白質(zhì)將其氨基酸鏈折疊成β-sheet可形成大量氫鍵交聯(lián)點(diǎn)。而絲素蛋白（SF）包含與CP19K相似的β-sheet構(gòu)象和產(chǎn)生氫鍵交聯(lián)的能力，提高材料韌性和水下粘附性能。為了進(jìn)一步預(yù)防傷口感染和加速組織愈合過(guò)程，研究人員分別將銀納米顆粒（Ag NPs）和脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)(dECM)引入到粘合劑中。從掃描電子顯微鏡圖像看出，C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠的微觀形貌呈現(xiàn)均勻多孔結(jié)構(gòu)，有利于吸收傷口部位的組織滲出物，為細(xì)胞增殖提供足夠的空間，縮短組織再生周期。

圖1. 雙仿生止血水凝膠的組成結(jié)構(gòu)。

【C-CTS/SA-Ag/dECM雙仿生止血水凝膠的粘附性能】

  C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠不僅能粘在豬皮膚組織，還可以與各種材料表面上，包括橡膠、玻璃和金屬等產(chǎn)生緊密的粘附。這主要?dú)w因于水凝膠和各種底物之間，通過(guò)氫鍵、配位鍵、陽(yáng)離子-π鍵、π-π相互作用和金屬螯合產(chǎn)生共價(jià)/非共價(jià)結(jié)合，具有很強(qiáng)的粘附性（圖2A?C）。研究人員還提出C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠具有與貽貝相似的長(zhǎng)期粘附特性。曾有報(bào)道稱，貽貝分泌的Mfp-3和Mfp-5蛋白確保濕組織粘附，而含有半胱氨酸殘基的Mfp-6蛋白則作為抗氧化劑，防止酚羥基氧化成醌基團(tuán)。這種連續(xù)的氧化還原反應(yīng)成為保證貽貝長(zhǎng)期粘附的關(guān)鍵因素。在當(dāng)前的系統(tǒng)中，SA-Ag的存在具有類似于Mfp-6蛋白的功能，它和TA之間的電子轉(zhuǎn)移在水凝膠中創(chuàng)造了一個(gè)動(dòng)態(tài)的酚-醌氧化還原環(huán)境，以維持TA和C-CHI中大量的兒茶酚基團(tuán)。因此，雙仿生止血水凝膠能在持續(xù)流動(dòng)水下緊密粘附在聚苯乙烯皿上60 s，在連續(xù)攪拌水中與豬皮膚保持長(zhǎng)達(dá)30天的粘附（圖2D和2E）。同時(shí)，在15個(gè)周期的剝離-粘合循環(huán)后，較于對(duì)照組的粘附強(qiáng)度有明顯優(yōu)勢(shì)（圖2H）。

圖2. 雙仿生止血水凝膠的可重復(fù)粘附性能。

【C-CTS/SA-Ag/dECM雙仿生止血水凝膠的自愈合性能】

  傷口與敷料協(xié)調(diào)配合、緊密接觸，有望加快止血速度，提高再生效率。傳統(tǒng)的水凝膠敷料在應(yīng)力作用下容易形成裂縫，這可能會(huì)影響網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致粘附功能喪失，并最終過(guò)早地從傷口部位脫落。此外，缺乏自愈合性能的水凝膠不能很好地處理不規(guī)則形狀的損傷，可能會(huì)提高傷口治療過(guò)程中細(xì)菌感染的概率，延緩愈合速度。在這種情況下，具有良好自愈合行為的止血水凝膠敷料可以抵抗因傷口活動(dòng)或外力引起的意外撕裂，從而在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中提供機(jī)械保護(hù)。在此，研究人員提出的C-CTS/SA-Ag/dECM雙仿生止血水凝膠具有動(dòng)態(tài)的靜電相互作用和可逆的氫鍵，這使它們具有表現(xiàn)出理想的自愈合行為的高潛力，能夠?qū)崿F(xiàn)加熱、空氣、水下多種模式下的愈合行為（圖3）。

圖3. 雙仿生止血水凝膠的自愈合性能。

【體外止血和生物相容性】

  一種理想的止血敷料可刺激血小板在損傷組織中的積累，并促進(jìn)血凝塊的形成。C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠的凝血指數(shù)(BCI)值在試驗(yàn)期間(5?50 min)呈下降趨勢(shì)，表明水凝膠具有良好的凝血性能（圖4B）。這種良好的凝血行為可以歸因于C-CHI陽(yáng)離子效應(yīng)，它通過(guò)激活紅細(xì)胞/血小板迅速觸發(fā)凝血機(jī)制。利用掃描電鏡進(jìn)一步分析了紅細(xì)胞在水凝膠表面的粘附和形態(tài)。從圖4C可以觀察到大量形態(tài)正常的紅細(xì)胞粘附在水凝膠表面，表明水凝膠捕獲紅細(xì)胞效果良好，且不影響其生理狀態(tài)。多孔結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞膜表面負(fù)電荷與水凝膠中氨基之間的靜電相互作用，增強(qiáng)了紅細(xì)胞的聚集能力。細(xì)胞毒性是止血?jiǎng)┖蛣?chuàng)面敷料在臨床應(yīng)用中不可缺少的條件。采用人正常肝細(xì)胞（LO2）的LIVE/DEAD染色試驗(yàn)和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）試驗(yàn)，研究水凝膠的細(xì)胞相容性（圖4D和4E）。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，研究人員提出的水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性，可以作為一種有效的創(chuàng)傷止血?jiǎng)┻M(jìn)一步應(yīng)用于體內(nèi)。

圖4. 雙仿生止血水凝膠的體外止血和生物相容性實(shí)驗(yàn)。

【雙仿生止血水凝膠在兔各種出血模型中的止血效果】

  為評(píng)價(jià)雙仿生止血水凝膠在臨床止血應(yīng)用的潛力，材料應(yīng)用于多種體內(nèi)出血模型，包括尾動(dòng)脈截肢、耳動(dòng)脈、肝臟、心臟穿刺等損傷，材料相應(yīng)的止血效果如圖5A?C所示。與未治療組（對(duì)照組）和紗布組相比，水凝膠由于協(xié)同作用，在20 s內(nèi)迅速止血。水凝膠可以緊密粘附在出血部位，通過(guò)形成機(jī)械屏障封閉傷口；同時(shí)，殼聚糖的陽(yáng)離子效應(yīng)可快速捕獲紅細(xì)胞和活化血小板，進(jìn)一步加速止血。為了驗(yàn)證所開發(fā)的水凝膠是否會(huì)影響機(jī)體的生命體征和基本生命活動(dòng)，在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中及時(shí)監(jiān)測(cè)手術(shù)兔的心電圖（ECG）和平均動(dòng)脈壓（MAP）。如圖5D所示，家兔的ECG和MAP指標(biāo)在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中的信號(hào)模式保持穩(wěn)定，表明雙仿生止血水凝膠具有理想的生物相容性，對(duì)動(dòng)物生命體征無(wú)不良影響。

圖5. 雙仿生止血水凝膠在各種兔出血模型中的止血性能評(píng)價(jià)。

【傷口愈合效果和抗菌性能評(píng)價(jià)】

  具有抗菌性能的止血密封劑，將非常有利于提高傷口愈合的效率。由于C-CHI和Ag NPs的存在，所開發(fā)的水凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌展現(xiàn)出理想的殺菌效果（圖6A&F）。鑒于水凝膠具有良好的組織粘附性、抗菌性能和止血性能，研究人員通過(guò)構(gòu)建兔皮膚切口模型，進(jìn)一步研究了雙仿生止血水凝膠的皮膚創(chuàng)面愈合效果（圖6B）。各治療組的創(chuàng)面均處于閉合狀態(tài)，但修復(fù)程度不一致。未經(jīng)治療的對(duì)照組出現(xiàn)明顯的瘢痕不均勻增生。與之形成鮮明對(duì)比的是，在C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠處理的傷口部位獲得了具有新表皮的再生光滑組織。圖6C?D的H&E染色和MT染色結(jié)果也進(jìn)一步證明，C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠在加速皮膚組織再生效果和降低增生性瘢痕率方面具有作為理想傷口敷料的巨大潛力。

圖6. 雙仿生止血水凝膠體外抗菌性能和體內(nèi)傷口愈合性能。

【水凝膠復(fù)合材料在豬致死性傷口的止血評(píng)價(jià)】

  在重大事故或戰(zhàn)場(chǎng)上，心臟/主動(dòng)脈損傷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的失血，并在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致死亡。因此，開發(fā)一種具有高止血效率的新型敷料對(duì)快速終止出血具有重要意義。本研究建立豬股動(dòng)脈和心臟穿刺出血模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)C-CTS/SA-Ag/dECM水凝膠在大規(guī)模致死性出血情況下的止血能力。圖7A和7B顯示，雙仿生止血水凝膠在沒(méi)有施加任何外力的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬心臟/股動(dòng)脈的止血效果，所開發(fā)水凝膠為臨床開發(fā)非加壓止血試劑提供了新的思路�？紤]到，不規(guī)則形狀的小而深的傷口通常屬于最大劑量的出血模型之一，如戰(zhàn)場(chǎng)上的槍傷和臨時(shí)裝置爆炸引起的腔室出血。研究人員利用市售聚乙烯醇（PVA）海綿具有良好的吸水和膨脹能力與雙仿生水凝膠相結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)致命的豬鎖骨下動(dòng)脈出血模型，以驗(yàn)證水凝膠-海綿復(fù)合材料對(duì)深層和狹窄傷口的止血效果。如圖7I所示，在保證止血效率的情況下，復(fù)合材料的使用量?jī)H需純PVA海綿組的一半。這種雙仿生水凝膠與PVA膨脹海綿的結(jié)合，最大限度地結(jié)合了化學(xué)和物理止血的優(yōu)勢(shì)，為非壓迫性深部傷口的急救治療提供了新的啟示。

圖7. C-CTS/SA-Ag/dECM 水凝膠和水凝膠-海綿復(fù)合材料在豬出血模型中的體內(nèi)止血特性。

  論文共同第一作者為福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院碩士生潘高星、石油化工學(xué)院碩士生李飛翰和福建省立醫(yī)院小兒外科主任醫(yī)師何少華。通訊作者為福州大學(xué)石油化工學(xué)院張進(jìn)教授和福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院楊黃浩教授。

  該工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、福建省科技重大專項(xiàng)、福建省自然科學(xué)基金、清源創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)項(xiàng)目等基金的資助。并感謝福建省雛鷹計(jì)劃青年拔尖人才項(xiàng)目及福建省科協(xié)青年托舉人才項(xiàng)目對(duì)張進(jìn)的大力支持。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202200908