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鄭州大學睢曉潔 AHM：可便捷用于傷口修復的干細胞低溫保存平臺
2025-01-12  來源：高分子科技

  近年來，負載干細胞的3D支架作為組織工程構建物為代替和修復受損組織（如皮膚、骨/軟骨、脊髓等）提供了一種極具前景的解決方案。該組織工程構建物的廣泛應用依賴于干細胞的高效低溫保存，但其仍面臨以下挑戰(zhàn)：1）干細胞在低溫保存時，需使用有毒冷凍保護劑（如DMSO）以抑制冰晶損傷；2）解凍復蘇后，需要進行復雜的洗脫步驟以去除這些有毒保護劑；3）解凍后的干細胞通常需要整合至3D支架中以便后續(xù)的組織工程應用。因此，開發(fā)一種基于3D支架的干細胞低溫保存平臺，并消除有毒冷凍保護劑的使用，提供“現(xiàn)貨型”組織工程構建物變得越來越重要。


  近日，鄭州大學生命科學學院睢曉潔副教授提出了一種新型的干細胞低溫保存平臺。該平臺通過聯(lián)合聚乙烯吡咯烷酮/結冷膠/明膠（PGG）抗凍支架包封策略和L-脯氨酸誘導的細胞預脫水策略，實現(xiàn)了干細胞的高效低溫保存（復蘇存活率達95%），且避免了傳統(tǒng)有毒冷凍保護劑（如DMSO）的使用。在解凍復蘇后，包封小鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）的PGG抗凍支架可作為組織工程構建物（BMSCs@PGG）直接應用于小鼠皮膚急性損傷修復，促進傷口愈合，為實現(xiàn)干細胞的高效保存和便捷應用提供了新思路。


  相關研究成果以“An Antifreezing Scaffold-based Cryopreservation Platform of Stem Cells for Convenient Application in Wound Repair”為題發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》雜志上。


圖1. 便捷用于傷口修復的干細胞低溫保存平臺示意圖


1. PGG抗凍支架的制備與表征


  為了避免低溫保存過程中與冰相關的損傷，作者使用聚乙烯吡咯烷酮、結冷膠/鈣離子和明膠設計制備了具有半互穿網絡結構的抗凍支架，命名為PGG支架（圖2A）。傅里葉紅外光譜證明了PGG支架的成功制備（圖2B）。同時，PGG支架具有優(yōu)異的溶脹性能和生物降解性能，有助于其包封細胞以及后續(xù)的組織工程應用（圖2C,D）。


圖2. PGG抗凍支架的制備與表征


  隨后作者分別從熱力學、動力學和原子尺度表征了PGG支架的抗凍性能。差示掃描量熱法（DSC）結果表明PGG支架具有降低冰點和可凍結水含量的能力，并且這種能力隨著結冷膠占比的增加而變強。以PGG4:1支架為例，低場核磁（LF-NMR）結果表明PGG4:1支架可以將水分子限制在支架內部，削弱水分子的流動性（圖3D,E）。拉曼光譜（Raman）結果顯示，PGG4:1支架能夠破壞水分子間氫鍵的有序排列（圖3F,G）。作者通過密度泛函理論計算證明了PGG4:1支架中的各個組分都與水分子有著更強的相互作用，使其能夠破壞水分子間的氫鍵網絡。這些結果顯示PGG4:1支架具有良好的抗凍能力，有利于抑制細胞在低溫保存過程中的冰相關損傷。


圖3. PGG支架抗凍性能的表征


2. L-脯氨酸誘導細胞預脫水


  PGG支架作為一種大分子材料，無法穿透細胞膜提供細胞內保護作用。因此，作者采用L-脯氨酸誘導的細胞預脫水策略，以降低細胞內的水分含量，進而抑制細胞內冰晶的形成，減少其對細胞的損傷。（圖4A）。實驗結果證實，通過調整L-脯氨酸的誘導時間，能夠有效控制細胞的脫水程度（圖4B,C）。并且，L-脯氨酸可以作為一種滲透調節(jié)劑，緩解細胞在低溫保存時所遭受的滲透脅迫（圖4D-G）。


圖4. L-脯氨酸誘導的細胞預脫水


3. 低溫保存平臺的構建


  基于此，作者提出了一種聯(lián)合PGG抗凍支架包封策略與L-Pro誘導細胞預脫水策略的低溫保存平臺，旨在保護BMSCs免受低溫損傷（圖5A）。作者首先證明了BMSCs可以很輕松地負載在PGG支架中，且這一過程并不會影響細胞存活率（圖5B-D）。通過對L-Pro使用濃度（圖5F）與孵育時間（圖5G）的篩選，最終選擇使用4% L-Pro孵育1 h后包封在PGG支架中進行低溫保存的策略，解凍后干細胞的即時存活率可達95%（圖5H），48 h存活率可達86%（圖5I）。同時，該低溫保存平臺具備長期保存BMSCs的能力（>大于4個月），且對其他來源（如大鼠骨髓來源）的間充質干細胞也具有高效的低溫保護作用（圖5J,K）。


圖5. 低溫保存平臺的構建


4. 生物相容性測試


  良好的生物相容性可以減少細胞與材料之間的不良反應，保障移植后細胞的存活和功能，推動臨床應用。作者通過細胞活/死熒光染色實驗、溶血實驗以及小鼠皮下包埋PGG4:1支架實驗，證明了平臺所用材料具有良好的細胞相容性（細胞存活率均高于95%）、血液相容性（溶血率均低于5%）和組織相容性（不引起急性和慢性炎癥）。與傳統(tǒng)的基于DMSO的低溫保存方法相比，該低溫保存平臺避免了在解凍后需要進行繁瑣的保護劑脫除步驟。


圖6. 生物相容性測試


5. 解凍后干細胞的體外功能評估


  鑒于低溫保存平臺的優(yōu)異生物相容性，作者將解凍后的BMSCs@PGG4:1作為組織工程構建物進行培養(yǎng)，以評估其解凍后干細胞的體外功能。細胞增殖和分化結果顯示，解凍后的BMSCs@PGG4:1不僅保持了增殖能力（圖7A），還展現(xiàn)出分化為脂肪細胞和軟骨細胞的潛力（圖7B）。旁分泌實驗結果如圖7C-F所示，經新鮮BMSCs@PGG4:1或凍存BMSCs@PGG4:1條件培養(yǎng)基（CMs）處理的L929細胞和HaCaT細胞，其增殖率和遷移率相較于空白對照組均顯著提升。綜上所述，低溫保存后的干細胞保持了增殖、分化和旁分泌能力。


圖7. 解凍后干細胞體外功能的評估


6. 解凍后的BMSCs@PGG作為組織工程構建物用于傷口修復


  進一步地，作者構建了小鼠皮膚急性損傷模型，以評估解凍后BMSCs@PGG4:1作為組織工程構建物在皮膚再生中的應用效果（圖8A）。如圖8B,C所示，新鮮BMSCs@PGG4:1組和凍存BMSCs@PGG4:1組傷口愈合速度與空白對照組相比明顯加快。治療后第14天，皮膚H&E染色圖像顯示，新鮮BMSCs@PGG4:1組和凍存BMSCs@PGG4:1組炎癥細胞浸潤減少，成纖維細胞增加，并伴有傷口區(qū)域新血管結構的形成（圖8D）。此外，相比于空白對照組和新鮮BMSCs組，新鮮BMSCs@PGG4:1組和凍存BMSCs@PGG4:1組第14天的新生皮膚具有較薄的表皮（圖8F）、較少肉芽組織（圖8G）、更完整的真皮（圖8H）以及更多的膠原沉積（圖8E,I）。


  免疫熒光結果顯示，新鮮BMSCs@PGG4:1組或凍存BMSCs@PGG4:1組均可以降低促炎因子IL-6、TNF-α的表達，提高IL-10、CD206抗炎因子及α-SMA、CD31促血管生成因子的表達（圖9）。綜上所述，低溫保存后的BMSCs@PGG4:1能夠有效調控傷口部位的炎癥反應、促進血管生成以及促進膠原蛋白的有序沉積，從而加速傷口愈合的過程。


圖8. 解凍后干細胞體內功能的評估


圖9. 第14天創(chuàng)面皮膚組織的免疫熒光染色。


  綜上，作者構建了一種新的BMSCs低溫保存平臺，該平臺通過使用PGG抗凍支架以抑制細胞外冰晶的形成，并聯(lián)合L-Pro誘導的細胞脫水策略以最大程度的減少細胞內冰晶的形成，最終實現(xiàn)了干細胞的高效低溫保存，且摒棄了傳統(tǒng)有毒保護劑的使用。由于PGG支架的優(yōu)異生物相容性和獨特的3D結構，解凍后的BMSCs@PGG不用進行任何洗滌過程，可以直接作為組織工程構建物用于治療小鼠皮膚急性損傷。


  鄭州大學碩士研究生周生熙、張琨副教授為該論文的共同第一作者，鄭州大學睢曉潔副教授為通訊作者。該研究獲得了國家自然科學基金、中國博士后科學基金、河南省重點研發(fā)與推廣專項和河南省海外創(chuàng)新人才引進等項目的資助。


  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adhm.202404228

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（責任編輯：xu）
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