80电影天堂网,少妇高潮一区二区三区99,jαpαnesehd熟女熟妇伦,无码人妻精品一区二区蜜桃网站

  三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵襲性和致死性的亞型，由于缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2的表達(dá)，導(dǎo)致傳統(tǒng)激素療法及靶向治療失效，臨床主要依賴化療但存在療效低、毒副作用顯著等局限。聯(lián)合治療已成為近年來TNBC的新型療法，如免疫治療與化療、放療以及靶向治療的組合，但存在免疫相關(guān)不良反應(yīng)的風(fēng)險。近年來，基于生物礦化的新型阻斷療法因其優(yōu)良生物相容性和持續(xù)誘導(dǎo)礦化能力在腫瘤治療領(lǐng)域備受關(guān)注。

  生物礦化是生物體對無機(jī)物質(zhì)成核、生長和定向組裝進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，進(jìn)而形成硬組織材料的過程。腫瘤靶向礦化阻斷策略，創(chuàng)新性地將病理性礦化引入腫瘤治療中。該策略主要依賴于羧基、雙膦酸鹽等基團(tuán)作為礦化位點(diǎn)誘導(dǎo)腫瘤組織周圍形成礦物質(zhì)屏障，這層物理屏障能夠有效阻斷腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境之間的營養(yǎng)代謝交換及信號分子傳遞，在乳腺癌、宮頸癌和骨肉瘤等惡性腫瘤治療中展現(xiàn)出顯著療效。此外，纖連蛋白（Fibronectin, FN）含有的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列能夠特異性識別腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的α_vβ₃整合素受體，兼具靶向識別性能和生物相容性。

  腫瘤組織的礦化過程會導(dǎo)致局部血液供應(yīng)減少，加重腫瘤的缺氧狀態(tài)。這一特性可被用于激活生物還原性藥物如替拉扎明（Tirapazamine, TPZ），促使其轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的活性形式。通過合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化基于生物礦化的阻斷治療和乏氧激活化療可以為TNBC聯(lián)合治療提供新的可能。

  含磷樹狀大分子因其良好的生物相容性和可修飾性，表現(xiàn)出極佳的蛋白、藥物的遞送效率，被廣泛用于腫瘤和炎癥等疾病的治療。尤其是，以雙膦酸鹽封端的含磷樹狀大分子不僅通過簡單物理作用高效負(fù)載蛋白質(zhì)，其末端基團(tuán)還可作為礦化誘導(dǎo)位點(diǎn)。因此，設(shè)計(jì)基于雙膦酸鹽封端的含磷樹狀大分子納米平臺有望整合腫瘤特異性識別、礦化誘導(dǎo)和藥物控釋等功能為一體用于協(xié)同治療TNBC。

  為此，東華大學(xué)沈明武研究員/史向陽教授團(tuán)隊(duì)與法國國家科學(xué)研究中心Jean-Pierre Majoral院士團(tuán)隊(duì)合作構(gòu)建了一種負(fù)載TPZ的含磷樹狀大分子/FN納米復(fù)合物（圖1）。研究團(tuán)隊(duì)以雙膦酸鹽封端的含磷樹狀大分子AK176為載體，通過氫鍵、陽離子-π及疏水相互作用將AK176與FN復(fù)合，進(jìn)一步通過靜電相互作用負(fù)載TPZ，得到AK176@FN/TPZ納米復(fù)合物（AFT NCs）。所制備的AFT NCs具有良好的穩(wěn)定性，能夠通過FN介導(dǎo)的靶向作用識別腫瘤細(xì)胞，并以AK176末端的雙膦酸鹽基團(tuán)作為鈣沉積位點(diǎn)誘導(dǎo)生物礦化，加劇腫瘤乏氧微環(huán)境激活TPZ，實(shí)現(xiàn)TNBC的協(xié)同阻斷治療/乏氧激活化療。

圖1. AFT NCs的制備及其介導(dǎo)三陰性乳腺癌協(xié)同治療機(jī)制。

  TEM圖像顯示所制備的AF NCs和AFT NCs的形貌為均勻分散的球形結(jié)構(gòu)，尺寸大小分別為102.9 nm和134.1 nm（圖2A-B）。AFM圖像顯示AF NCs和AFT NCs的高度分別為15.6 nm和26.1 nm，初步證明TPZ在AF NCs中的成功負(fù)載（圖2C-D）。此外，UV-vis圖譜、SDS-PAGE圖像以及表面電勢進(jìn)一步證明了FN和TPZ的成功負(fù)載（圖2E-H）。AFT NCs的水合動力學(xué)尺寸為244.2 nm，PDI為0.21，表面電勢為-10.8 mV（圖2G-H）。

圖2.（A）AF NCs和（B）AFT NCs的TEM圖像及尺寸分布直方圖；（C）AF NCs和（D）AFT NCs的AFM圖像及高度分布圖；不同材料的（E）UV-Vis圖譜、（F）SDS-PAGE圖譜、（G）水合粒徑和（H）表面電勢。

  研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)AFT NCs在30分鐘孵育時間內(nèi)能最大程度地定位在MDA-MB-231細(xì)胞膜表面（圖3A），并通過FN介導(dǎo)的靶向作用特異性結(jié)合α_vβ₃整合素（圖3B）。CLSM和共定位分析進(jìn)一步證明，AFT NCs與細(xì)胞孵育30 min使納米材料傾向于附著在細(xì)胞膜表面而非內(nèi)化（圖3C-D）。AFT NCs的雙膦酸鹽基團(tuán)可有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞膜表面的生物礦化，在無外源鈣補(bǔ)充條件下，AFT NCs能利用培養(yǎng)基中的鈣形成磷酸鈣礦化層，表現(xiàn)為明顯的鈣黃綠素相關(guān)的綠色熒光信號（圖3E），而額外補(bǔ)充鈣的AFTC組礦化效果更明顯（圖3F）。EDX分析顯示，礦化層由無序的鈣磷沉積物組成，Ca/P比接近羥基磷灰石理論值（圖3G-H）。此外，AFTC處理可特異性降低MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)液的鈣濃度（圖3I-J），表明AFT NCs能夠定位到腫瘤細(xì)胞表面并吸附外源性鈣離子，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向生物礦化。

圖3.（A）MDA-MB-231細(xì)胞與AFT-FITC共孵育不同時間，臺盼藍(lán)淬滅前后的熒光強(qiáng)度流式細(xì)胞圖；MDA-MB-231細(xì)胞與AFT-FITC共孵育30分鐘后的（B）流式細(xì)胞圖和（C）CLSM圖像；（D）細(xì)胞膜與AFT-FITC的共定位分析：煙花圖像及皮爾遜相關(guān)系數(shù)；（E）經(jīng)不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞表面CaP層的CLSM圖像；（F）經(jīng)不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞的SEM圖像及鈣元素分布圖；（G-H）PBS和AFTC處理后MDA-MB-231細(xì)胞的EDX能譜圖；經(jīng)不同處理后（I）L929細(xì)胞和（J）MDA-MB-231細(xì)胞上清液中Ca²⁺濃度。

  接下來，研究團(tuán)隊(duì)通過一系列體外實(shí)驗(yàn)探究AFT NCs介導(dǎo)的生物礦化策略的抗腫瘤機(jī)制（圖4A）。由于FN介導(dǎo)的靶向作用，AFTC誘導(dǎo)的細(xì)胞表面礦化能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，而對正常L929細(xì)胞無明顯影響（圖4B）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，生物礦化處理后的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率顯著增強(qiáng)（圖4C），同時其遷移和侵襲能力也受到抑制，且該抑制效果隨著鈣離子補(bǔ)充而增強(qiáng)（圖4D-I）。這些結(jié)果表明，外源鈣離子的補(bǔ)充促進(jìn)AFT NCs的生物礦化的效果，抑制細(xì)胞內(nèi)氧氣和能量的運(yùn)輸，從而激活乏氧前藥TPZ的化療活性，導(dǎo)致有效的癌細(xì)胞凋亡和抗遷移/侵襲能力，為AFT NCs在體內(nèi)抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移提供了依據(jù)。

圖4.（A）生物礦化處理MDA-MB-231細(xì)胞的示意圖；（B）經(jīng)不同處理后L929和MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞活力圖；經(jīng)不同處理后MDA-MB-231細(xì)胞的（C）凋亡流式分析圖、（D-E）劃痕實(shí)驗(yàn)、（F-G）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及（H-I）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的代表性圖像和定量數(shù)據(jù)。

  隨后，研究團(tuán)隊(duì)通過RNA測序揭示了AFTC誘導(dǎo)的細(xì)胞表面礦化作用機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，AFTC處理組與PBS組存在487個差異表達(dá)基因（176個上調(diào)，311個下調(diào)）（圖5A）。KEGG富集分析表明，礦化作用主要通過影響IL-17、PI3K-Akt、HIF-1α等信號通路，以及細(xì)胞黏附因子和代謝合成來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（圖5B-C）。GO分析顯示差異基因顯著富集于“生物調(diào)控”、“代謝過程”、“缺氧響應(yīng)”等生物學(xué)過程（圖5D-E）。熱圖顯示，AFTC組中EDN2、NOX5等促遷移基因表達(dá)下調(diào)，而TNFSF14等促凋亡基因表達(dá)上調(diào)（圖5G）。這些結(jié)果說明AFTC誘導(dǎo)的膜礦化通過破壞代謝穩(wěn)態(tài)、誘導(dǎo)凋亡和抑制遷移等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖5.（A）PBS和AFTC處理后MDA-MB-231細(xì)胞的差異表達(dá)基因火山圖；差異表達(dá)基因（B）KEGG注釋分類及（C）富集分析；差異表達(dá)基因（D）GO注釋分類及（E）生物學(xué)過程、（F）分子功能層面的富集分析；（G）|log2(FC)|≥1.5的代表性差異表達(dá)基因熱圖。

  研究團(tuán)隊(duì)通過構(gòu)建MDA-MB-231三陰性乳腺癌原位移植瘤模型驗(yàn)證AFT NCs的體內(nèi)治療效果（圖6A）。在圖6B-C中，AFTC可通過增強(qiáng)的生物礦化作用協(xié)同加劇腫瘤缺氧來激活TPZ，從而顯著抑制腫瘤生長。ICP-OES檢測顯示AFT和AFTC組腫瘤組織鈣含量顯著升高（圖6D）。Micro-CT成像進(jìn)一步證實(shí)AFT NCs介導(dǎo)的生物礦化能在腫瘤組織周圍作用形成致密的礦物層（圖6E-F）�？偟膩碚f，通過生物礦化介導(dǎo)的阻斷治療與缺氧激活化療的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了顯著的體內(nèi)抗腫瘤效果。

圖6.（A）原位三陰性乳腺癌異種移植模型的治療時間線；（B）治療期間各組小鼠腫瘤體積變化；治療后各組小鼠（C）腫瘤代表性照片、（D）腫瘤組織的鈣含量、（E）腫瘤組織Micro-CT成像圖及（F）礦化體積定量結(jié)果。

  研究團(tuán)隊(duì)通過組織學(xué)分析揭示了AFT NCs的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制。治療后小鼠腫瘤組織壞死區(qū)域增加、增殖指標(biāo)（Ki-67）減少、凋亡指標(biāo)（caspase-3）增加和乏氧指標(biāo)（HIF-1α）表達(dá)增加，表明礦化作用加劇了腫瘤微環(huán)境的缺氧，從而激活TPZ的化療活性（圖7A-B）。此外，存活率和肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，AFT NCs介導(dǎo)的生物礦化策略能夠增加小鼠的存活率及有效抑制體內(nèi)腫瘤肺轉(zhuǎn)移（圖7C-D）。

圖7.治療后各組小鼠腫瘤組織的（A）H&E染色及（B）Ki-67、Caspase-3和HIF-1α免疫熒光染色結(jié)果；（C）治療后各組小鼠的生存率；（D）治療后各組小鼠肺組織的代表性照片及H&E染色結(jié)果。

  簡而言之，該研究設(shè)計(jì)的負(fù)載TPZ的含磷樹狀大分子/FN納米復(fù)合物（AFT NCs）具有多個優(yōu)勢：1）AK176末端的雙膦酸鹽基團(tuán)可作為鈣沉積的誘導(dǎo)位點(diǎn)；2）含磷樹狀大分子共負(fù)載FN和TPZ，不僅能實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向生物礦化，還能通過加劇腫瘤乏氧微環(huán)境激活TPZ的化療活性；3）所構(gòu)建的AFT NCs具有腫瘤特異性阻斷治療與化療協(xié)同效應(yīng)，可有效抑制TNBC進(jìn)展與轉(zhuǎn)移。這項(xiàng)研究為TNBC治療提供了一種新型的生物礦化策略，有望應(yīng)用于治療其他惡性腫瘤。

  以上研究成果以“Phosphorous Dendrimer-Mediated Biomineralization for Synergistic Blockade Therapy and Hypoxia-Activated Chemotherapy of Tumors”為題，在線發(fā)表于國際著名期刊Acta Biomaterialia (DOI: 10.1016/j.actbio.2025.04.038)。東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院沈明武研究員、史向陽教授與鄒瑜（博士后）為共同通訊作者，東華大學(xué)碩士研究生梁佳佳為第一作者。該工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、上海市科委項(xiàng)目等的資助。

  文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2025.04.038