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  免疫治療逐漸成為應對惡性腫瘤的一大重要手段，其通過激活機體免疫系統(tǒng)，識別并殺死特定的腫瘤細胞，產生免疫記憶效應，具有更為持久的療效，包括免疫檢查點阻斷、嵌合抗原受體T細胞免疫療法（CAR-T）、T細胞受體工程化T細胞療法（TCR-T）等在內的免疫療法已取得巨大成功。近年來，腫瘤疫苗作為免疫療法的新興成員，引發(fā)了廣泛關注。然而，目前傳統(tǒng)腫瘤疫苗存在抗原/佐劑包載效率低、淋巴結回流能力較差、體內利用率低和功能單一化等缺點，療效不佳。

  隨著納米技術的快速發(fā)展，基于各類生物材料的納米載體已經成為腫瘤治療的強大平臺，將納米載體應用于腫瘤疫苗的開發(fā)有望為上述問題提供解決方案。一般來說，納米材料可以通過靜電相互作用、疏水相互作用以及共價結合等多種方式實現(xiàn)對抗原和佐劑的高效包載。同時，納米載體易于多功能化，有助于實現(xiàn)不同治療方式與免疫治療的聯(lián)合，克服單一腫瘤治療模式存在的缺點。

  光熱治療（PTT）通過加熱消融腫瘤產生腫瘤抗原以及其他免疫信號來激活抗腫瘤免疫反應。納米硫化銅（CuS）以其制備簡單、成本低及表面等離子體共振吸收引起的光熱性能等特性受到了較多的關注。樹狀大分子具有高度支化、結構穩(wěn)定可控、表面高官能化、低細胞毒性、無免疫原性等優(yōu)勢，是優(yōu)良的載體基材。其中，聚酰胺-胺（PAMAM）樹狀大分子因其表面富含大量氨基，可與帶負電荷的抗原及免疫佐劑產生良好相互作用，在構建腫瘤疫苗上具有潛力。與此同時，在其表面修飾苯硼酸（PBA）可與不同類型的蛋白質具有高結合親和力，形成穩(wěn)定的復合物，實現(xiàn)良好的胞內傳遞效率。

  在研究團隊早期工作中，已經證明兩性離子修飾的PAMAM樹狀大分子可用于模板合成CuS納米顆粒，具有良好的光熱轉換效率，用于腫瘤的化療/光熱治療（Small Methods 2021, 5, 2100204）和光熱/基因治療（ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 6069-6080）。基于此，他們假設，構建表面修飾PBA分子、內部包裹硫化銅納米顆粒的第五代PAMAM樹狀大分子與STING激動劑cGAMP的復合物，不僅可以通過PTT觸發(fā)腫瘤免疫原性死亡并釋放腫瘤抗原，還可以通過捕獲原位生成的腫瘤抗原，進而形成納米疫苗，實現(xiàn)PTT/免疫聯(lián)合治療。

  研究團隊首先通過Uv-vis、TEM和光熱轉換性能測試證明了G5-PBA@CuS的成功合成，并具有良好的光熱轉換能力（圖2a-e）。通過與BSA進行蛋白吸附實驗，根據吸附前后吸光度差值可以得到經PBA修飾的材料能夠很好地吸附蛋白（圖2f）。該研究以小鼠黑色素瘤（B16-F10）為模型進行了體外、體內研究，在細胞毒性實驗中，未經激光照射的細胞均保持較高的細胞活力，說明G5-PBA@CuS具有良好的細胞相容性；激光照射后，隨著Cu濃度的增加，細胞活力逐漸降低，表明G5-PBA@CuS對B16-F10細胞具有良好的光熱消融效果（圖2g）。細胞吞噬結果表明，G5-PBA@CuS能更好的被B16-F10細胞所吞噬（圖2h）。通過BCA檢測抗原吸附量表明G5-PBA@CuS具有優(yōu)異的抗原捕獲能力（圖2i），從而為納米疫苗的構建提供便利。

 圖2.（a）不同濃度的G5-PBA@CuS的UV-vis光譜圖；G5-PBA@CuS（b）TEM圖片和（c）粒徑分布直方圖；（d）水和不同濃度的G5-PBA@CuS水溶液的光熱升溫曲線和（e）單個升降溫循環(huán)曲線圖；（f）不同濃度的G5-PBA@CuS和G5-NHAc@CuS與BSA孵育離心前后吸光度變化；（g）不同處理后B16-F10細胞CCK-8活力測試；（h）不同處理后B16-F10細胞對材料攝取情況；（i）BCA檢測不同濃度的材料處理癌細胞后的抗原吸附量。

圖3. 各組材料與B16-F10細胞共孵育后，（a）CRT的表達，（b）ATP的分泌，（c）HMGB-1的釋放情況分析圖；（d-e）各組材料刺激DCs熟化的分析圖；（f-g）不同處理后DCs上MHC-II表達的分析圖；（h）不同處理后DCs釋放IFN-β量。對于（a-h）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，G5-PBA@CuS；Ⅲ，G5-PBA@CuS/cGAMP；Ⅳ，G5-PBA@CuS + Laser；V，G5-PBA@CuS/cGAMP + Laser ([Cu] = 0.8 mM， [cGAMP] = 1 μg/mL)。

圖4. （a）小鼠體內治療過程示意圖；（b-c）治療14天內小鼠體重及腫瘤體積變化曲線；（d）不同治療后的小鼠生存曲線圖；（e）治療第14天腫瘤切片的TUNEL、Ki-67和CRT染色結果。（f-h）CD4+、CD8+T細胞和Tregs的流式定量圖。對于（b-h）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，G5-PBA@CuS；Ⅲ，G5-PBA@CuS/cGAMP；Ⅳ，G5-PBA@CuS + Laser；V，G5-PBA@CuS/cGAMP + Laser。

圖5. （a）小鼠體內治療過程示意圖；（b-c）治療14天內小鼠體重及遠端瘤體積變化曲線；（d）治療第14天遠端瘤切片的CD4+ T細胞和CD8+ T細胞染色結果；（e-g）CD4+ T細胞、CD8+ T細胞和Tregs的流式定量圖。

圖6. （a）荷瘤小鼠體內治療過程示意圖；（b-c）治療期間小鼠體重及腫瘤體積變化曲線；（d）不同治療后的小鼠照片；（e-f）腫瘤部位CD4+、CD8+ T和Tregs細胞的流式分析；（g-i）CD4+、CD8+T細胞和Tregs的流式定量圖。

圖7. （a）小鼠體內治療過程示意圖；（b-c）治療期間小鼠體重及腫瘤體積變化曲線；（d）不同治療后的小鼠照片；（e-f）脾臟部位CD4+、CD8+ T細胞和Tregs的流式分析；（g-i）CD4+、CD8+T細胞和Tregs的流式定量圖。

  簡言之，該研究設計的G5-PBA@CuS/cGAMP納米顆粒具有以下優(yōu)勢：1）所構建的納米顆粒具有優(yōu)異的光熱轉換效率和蛋白質吸附特性，并可與STING激活劑cGAMP復合后用于腫瘤的光熱/免疫治療，從而誘導免疫原性死亡，激活免疫系統(tǒng)；2）在激光照射后，G5-PBA@CuS/cGAMP復合物可有效聯(lián)合PTT/免疫治療抑制原發(fā)腫瘤，同時通過修飾的PBA分子捕獲原發(fā)腫瘤抗原，形成原位疫苗，產生適應性免疫反應，從而有效抑制遠端腫瘤的生長；3）在體外制備得到的G5-PBA@CuS/antigen/cGAMP復合物可作為預制納米疫苗，對原發(fā)腫瘤進行免疫治療，并通過所產生的免疫記憶效應來預防腫瘤的發(fā)生。本研究制備的G5-PBA@CuS/cGAMP納米顆粒為構建納米疫苗提供了新的思路。

  文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.01.076