蛋白類藥物因其高特異性和低副作用而越來越被認(rèn)為是藥物開發(fā)和疾病治療領(lǐng)域中有希望的候選者。然而，大多數(shù)蛋白質(zhì)由于分子量大、膜滲透性差、易被酶降解等特點而難以穿過細(xì)胞膜并作用于細(xì)胞內(nèi)疾病靶點。因此，開發(fā)針對細(xì)胞內(nèi)疾病靶點的簡單高效的蛋白質(zhì)遞送技術(shù)是擴大蛋白質(zhì)藥物應(yīng)用場景的重要途徑。
一般來說，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送的策略包括物理方法（如電穿孔、納米針、微流控和T細(xì)胞介導(dǎo)的孔形成）或化學(xué)方法（如蛋白質(zhì)與細(xì)胞穿透肽、轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、兩親性小分子等滲透性模塊的共價結(jié)合）。盡管這些細(xì)胞內(nèi)遞送蛋白質(zhì)的方法有效，但也存在不可忽視的缺點，包括依賴于苛刻的設(shè)備條件、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾需要花費額外的時間和費用、細(xì)胞活力受損、蛋白質(zhì)活性降低、內(nèi)涵體逃逸效率差等。在這種情況下，基于非共價相互作用的納米載體，如脂質(zhì)體、納米凝膠、外泌體和聚合物為有效的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送提供了更多的選項。
在眾多的納米載體體系中，表面修飾磷酯酸鈉鹽的陰離子型含磷樹狀/樹冠大分子具有特定的生物活性，如抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進NK細(xì)胞增殖等特性。因此，各種基于含磷樹狀/樹冠大分子的納米平臺已被構(gòu)建用于化療藥物的胞內(nèi)遞送。其中，陽離子型含磷樹狀大分子、PAMAM、PEI等高分子載體與蛋白質(zhì)的相互作用已被報道并被應(yīng)用到蛋白質(zhì)的胞內(nèi)遞送中。然而，考慮到高密度的正電荷可能會導(dǎo)致不可預(yù)測的細(xì)胞毒性，因此，依賴負(fù)電荷遞送蛋白質(zhì)到細(xì)胞內(nèi)的必要性需要重新評估。此外，大量載體的不合理使用所導(dǎo)致的代謝和清除不良，也可能引發(fā)機體毒性。因此，開發(fā)基于具有固有免疫調(diào)節(jié)活性的陰離子型含磷樹狀大分子的蛋白質(zhì)胞內(nèi)遞送載體有望解決以上問題，并可通過載體和蛋白質(zhì)的功能協(xié)同發(fā)揮增強的治療效果。
圖1. 含磷樹狀大分子AK-137通過各種物理相互作用與蛋白質(zhì)絡(luò)合用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的遞送。
圖2.（A）不同含磷樹狀大分子的結(jié)構(gòu)圖；（B-D）流式細(xì)胞術(shù)分析不同含磷樹狀大分子處理RAW264.7細(xì)胞后細(xì)胞表面CD86和CD206的表達變化；（E）含磷樹狀大分子抑制RAW264.7細(xì)胞釋放亞硝酸鹽的能力；（F）不同含磷樹狀大分子胞內(nèi)遞送BSA的效率。
圖3.（A-B）AK-137與BSA在不同質(zhì)量比下的水合粒徑和表面電勢；（C）Cy5.5-BSA的熒光發(fā)射光譜；（D）AK-137@BSA NCs的TEM圖像；（E-F）AK-137和AK-137@BSA NCs的AFM圖和相應(yīng)高度圖；（G）AK-137@BSA NCs一周內(nèi)的水合粒徑變化；（H-I）AK-137@BSA NCs細(xì)胞內(nèi)攝取的流式圖和CLSM圖像；（J-K）不同內(nèi)吞抑制處理的細(xì)胞對AK-137@BSA NCs攝取水平的變化。
研究團隊進一步探究了FN的胞內(nèi)遞送產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。巨噬細(xì)胞極化實驗顯示AK-137和FN均能在一定程度上誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞群體從M1表型向M2表型極化，但是效果是有限的。AK-137@FN NCs在AK-137和FN的協(xié)同以及增強的FN胞內(nèi)遞送效果的共同作用下表現(xiàn)出最低的CD86水平和最高的CD206水平（圖5A-C）。同時，AK-137@FN NCs也可以有效促進巨噬細(xì)胞中Arg-1水平的升高，抑制iNOS的表達（圖5D），有效促進巨噬細(xì)胞向抗炎M2表型的極化。另外，AK-137通過促進FN的細(xì)胞內(nèi)遞送進一步放大了FN的抗氧化能力，有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平（圖5E-F）。得益于AK-137@FN NCs優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化性能，LPS激活的巨噬細(xì)胞內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表達水平也被有效降低，并且這種抗炎性能可能是通過抑制PI3K/Akt和NF-κB信號通路實現(xiàn)的（圖5G-J）。
圖5.（A-C）不同材料處理后MH-S細(xì)胞表面CD86和CD206表達水平的流式檢測結(jié)果；（D）不同材料處理后MH-S細(xì)胞中Arg-1和iNOS的表達水平；（E-F）不同材料處理后MH-S細(xì)胞中ROS水平變化；（G-I）qPCR分析不同材料處理后細(xì)胞內(nèi)促炎性細(xì)胞因子的相對mRNA表達水平；（J）Western blot分析不同材料處理后MH-S細(xì)胞中p-Akt和NF-κB的表達水平。
圖6.（A）ALI小鼠體內(nèi)抗炎治療示意圖。（B-E）不同材料治療后ALI小鼠BALF中促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）和抗炎因子IL-10的表達水平。（F-H）不同組ALI小鼠治療24 h后肺組織中性粒細(xì)胞百分比和BALF中中性粒細(xì)胞生物標(biāo)志物MPO的表達水平。（I-J）不同處理組ALI小鼠肺干濕重比和肺損傷評分。
圖7.（A）AGA體內(nèi)抗炎治療示意圖。（B-C）不同材料處理后AGA小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度和踝關(guān)節(jié)代表性熱像圖。（D）不同材料處理后AGA小鼠踝關(guān)節(jié)的H&E染色。（E-F）不同材料處理后AGA小鼠踝關(guān)節(jié)組織TNF-α和IL-1β的免疫熒光染色。
簡而言之，該研究設(shè)計的基于含磷樹狀大分子的蛋白質(zhì)遞送平臺具有多個優(yōu)勢：1）合成了具有固有免疫調(diào)節(jié)活性、穩(wěn)定的含磷樹狀大分子；2）提供了一種“簡單、有效和非侵入性”的蛋白質(zhì)遞送策略，不需要對載體和蛋白質(zhì)進行額外的功能修飾；3）含磷樹狀大分子AK-137通過促進功能蛋白的細(xì)胞內(nèi)遞送改善了其生物利用度，可在不同的靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮各自的功能，包括癌細(xì)胞凋亡、樹突細(xì)胞成熟或巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)等；4）構(gòu)建的AK-137@FN復(fù)合物通過增強FN的胞內(nèi)遞送并協(xié)同AK-137載體自身抗炎性能，在急性肺損傷和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型中展現(xiàn)出良好的治療效果。該研究為非陽離子型聚合物基的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)遞送載體的合理設(shè)計提供了重要的思路，因而可能擴展蛋白質(zhì)藥物的廣泛生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acsnano.3c09589
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