周圍神經(jīng)在人體分布廣泛，疾病和意外事故造成的組織損傷往往伴隨局部周圍神經(jīng)的缺失或損壞。由于周圍神經(jīng)結構復雜，很難依靠基體實現(xiàn)自我修復，導致缺損神經(jīng)所控制的感覺和所支配的運動受到影響，顯著影響患者生活質量。目前對于長距離周圍神經(jīng)缺損的臨床治療方法主要采用自體神經(jīng)移植。自體移植是臨床的黃金標準，但由于受到供體來源和修復距離的限制，無法完全滿足臨床需求。近年來人工神經(jīng)導管已成為治療長距離周圍神經(jīng)缺損的重要方法，現(xiàn)有神經(jīng)導管產(chǎn)品因存在缺乏生物活性、無法傳遞電生理信號等問題，對長距離周圍神經(jīng)缺損修復效果欠佳，難以達到自體移植的修復效果，更多地作為自體移植后的神經(jīng)保護裝置使用。目前研究以及臨床實踐表明，采用電活性材料構建人工神經(jīng)導管，賦予人工神經(jīng)導管導電或自發(fā)電的電活性，構建有利于周圍神經(jīng)再生的電生理微環(huán)境，是提高人工神經(jīng)導管修復效果的有效策略。但目前仍然缺乏具有導電性和自發(fā)電性一體的人工神經(jīng)導管，并且電活性材料在周圍神經(jīng)修復領域的應用還面臨著起效機制不明確，應用形式受限，無法滿足臨床實際手術需求等挑戰(zhàn)。此外，電活性材料對免疫微環(huán)境的調控規(guī)律及其促周圍神經(jīng)再生的分子機制尚不清楚。這都極大地限制了電活性人工神經(jīng)導管在治療周圍神經(jīng)缺損中的應用。
針對以上問題，華南理工大學曹曉東教授與高會場副教授報道了一種具有導電與壓電雙重電活性的PVDF/PLCL/PEDOT人工神經(jīng)導管，該導管具有良好的自發(fā)電性能，可以通過促進雪旺細胞的成熟、成髓鞘以及分泌活性因子來促進缺損周圍神經(jīng)的再生。該工作從分子細胞學的角度闡明了電活性材料調節(jié)免疫微環(huán)境促進周圍神經(jīng)修復再生的可能分子機制：通過上調巨噬細胞的鈣離子通道蛋白從而激活PI3K/AKT-Nrf2 抗炎信號通路，最終促進巨噬細胞的募集、M2 極化以及抗炎蛋白分泌，同時通過調節(jié)巨噬細胞的旁分泌系統(tǒng)募集雪旺細胞并促進其成熟，進而間接促進周圍神經(jīng)修復。該工作以“Engineered PVDF/PLCL/PEDOT Dual Electroactive Nerve Conduit to Mediate Peripheral Nerve Regeneration by Modulating the Immune Microenvironment”為題發(fā)表在國際權威期刊Advanced Functional Materials上（Adv. Funct. Mater. 2024, 2400217），曹曉東教授和高會場副教授為該文的通訊作者，華南理工大學2021級碩士研究生王琪琪為文章第一作者。
圖1 PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性人工神經(jīng)導管通過調節(jié)免疫微環(huán)境間接促進周圍神經(jīng)修復示意圖。
圖2. PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性復合薄膜的制備與性能表征
以PVDF、PLCL、PEDOT為材料，通過退火結晶以及相分離的制備工藝（圖2A）制備了PEDOT納米粒子分散均勻且具有微孔結構的PVDF/PLCL/PEDOT復合薄膜（圖2B）。該復合薄膜具有良好的力學性能（圖2C），最大拉伸應力可達15.4MPa，可伸長至681%以上（圖2D），能夠滿足在實際應用中耐縫合以及抗扭結的力學需求。復合膜的電導率達到6.99×10-7S/cm，可促進雪旺細胞髓鞘化（圖2E），同時退火結晶的工藝保留了PVDF的β壓電結晶相（圖2F-G），保證了其復合膜具有壓電性能。
圖3 PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性材料的電學性能及其生物相容性
為了評估材料良好的導電性是否可以在體內傳遞電信號，將復合膜卷曲成管狀，植入大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，然后收集復合肌肉動作電位（CMAP），發(fā)現(xiàn)電活性神經(jīng)導管可以在一定程度上傳遞神經(jīng)電信號，可植入初期作為“人工神經(jīng)”替代缺損神經(jīng)傳遞電信號（圖3B）。同時，當對PVDF/PLCL/PEDOT復合膜施加不同大小的機械力（0.5 N、2 N、4 N），復合膜發(fā)出不同電壓水平（1.44 V、1.84 V、3.2 V）（圖3D），表明電活性復合膜可以將機械能轉化為電能，當其在體內接受到肌肉的擠壓時可以自發(fā)電刺激，從而刺激受損神經(jīng)再生。此外，PVDF/PLCL/PEDOT復合膜也具有良好的生物活性（圖3E-F）。
圖4. PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性材料促進周圍神經(jīng)修復的有效性驗證
首先通過體外細胞實驗和體內動物實驗驗證了PVDF/PLCL/PEDOT復合膜對周圍神經(jīng)修復的有效性。結果發(fā)現(xiàn)， PVDF/PLCL/PEDOT復合膜可顯著上調表達SOX-10、BDNF 和NGF，并下調表達的NCAM基因（圖4F），這表明雙重電活性復合膜能有效促進雪旺細胞的增殖，成熟、成髓鞘。進一步將其卷曲成管，植入大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，評價其坐骨神經(jīng)修復效果。結果表明，電活性神經(jīng)導管可以顯著促進髓鞘形成和軸突伸長，并促進再生神經(jīng)中新生血管成熟，修復效果與自體移植組相近（圖4A-E）。
圖5.PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性神經(jīng)導管促進缺損坐骨神經(jīng)信號傳導功能恢復及其支配的運動功能重建
本研究進一步通過Masson染色、SFI運動功能指數(shù)以及CMAP肌肉動作電位測定評估PVDF/PLCL/PEDOT電活性神經(jīng)導管促進缺損坐骨神經(jīng)信號傳導功能恢復及其支配的運動功能重建的效果。結果顯示，導管組可以抑制受損神經(jīng)所支配腓腸肌的萎縮，減少膠原沉積（圖5 A-B），所有實驗組在第1周時都已與空白對照組的SFI指數(shù)出現(xiàn)顯著差異，并且隨著時間的推移，顯著差異越來越大（圖5C）。CMAP的結果表明，導管組傳導電信號的功能與自體移植組相似（圖5D-F）。這些結果表明，電活性神經(jīng)導管在促進受損周圍神經(jīng)再生方面具有優(yōu)越的功效，其修復效果甚至可以與自體神經(jīng)移植物相媲美。值得一提的是，導管+超聲組在各個維度上修復效果都次于導管組，這是由于超聲形成的熱效應和空化效應對組織修復產(chǎn)生不利影響。
圖6. 雙重電活性材料通過介導巨噬細胞行為影響雪旺細胞
眾所周知，當組織損傷發(fā)生時，免疫系統(tǒng)的反應對組織修復至關重要。本研究通過巨噬細胞與雪旺細胞共培養(yǎng)實驗，探究了在電活性材料的介導下，巨噬細胞對雪旺細胞的影響。結果表明，電活性復合薄膜可以通過影響巨噬細胞的旁分泌系統(tǒng)對雪旺細胞產(chǎn)生良好的募集效果（圖6A），并且可以顯著促進雪旺細胞成熟、成髓鞘和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子（圖6B-C）。進一步探索雙重電活性復合薄膜對巨噬細胞的具體作用。結果發(fā)現(xiàn)，電活性材料具有募集巨噬細胞的能力，并且導電和壓電性具有協(xié)同促進巨噬細胞募集的效果（圖6D）。此外，其還有效地上調了抗炎因子（ARG-1、CD163）的表達，而下調了促炎因子（TNF-α，IL-1β）的表達（圖6E）。然而PLCL/PEDOT導電薄膜與PVDF/PLCL壓電薄膜并沒有顯示同樣的效果，說明導電性和壓電性在發(fā)揮抗炎效果的層面具有顯著的協(xié)同作用。這些結果表明雙重電活性材料具有調節(jié)巨噬細胞向 M2 抗炎表型的轉變的能力（圖6F）。
圖7. 雙重電活性復合薄膜激活了PI3K/AKT-Nrf2信號通路達到抗炎效果。
為了進一步確定電活性材料具有抗炎作用的分子機制，本研究通過RT-qPCR實驗，WB實驗以及免疫熒光染色實驗對可能的信號機制進行篩選 (圖7)。研究發(fā)現(xiàn)，電活性材料可以上調PI3K，AKT以及Nrf-2的基因表達，并上調p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平。并通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)PVDF/PLCL/PEDOT組中核轉錄因子Nrf2發(fā)生了核轉移。初步判定PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性復合膜具有通過促進PI3K和AKT的磷酸化，進而促進Nrf-2的核轉移來達到調控炎癥環(huán)境，上調抗炎蛋白表達而抑制促炎蛋白表達的效果。為了進一步驗證這一論點，在巨噬細胞培養(yǎng)過程中添加PI3K抑制劑LY294002，抑制PI3/AKT信號通路的激活，發(fā)現(xiàn)添加抑制劑后所有組別的PI3K均無上調，且其下游抗炎蛋白CD163和ARG-1的也未被上調，因此反向驗證了電活性復合膜確是通過激活PI3K/AKT信號通路調節(jié)炎癥環(huán)境。
圖8. 體內動物實驗證明PVDF/PLCL/PEDOT雙重電活性導管通過激活PI3K/AKT信號通路調節(jié)免疫微環(huán)境
為了進一步確認電活性材料在復雜的體內環(huán)境中仍然具有同樣的抗炎效果，本研究將PVDF/PLCL/PEDOT復合膜卷曲成神經(jīng)導管移入到大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損模型中，分別在第1周和第4周將在受損神經(jīng)組織的遠端、近端以及再生部分解剖離體，采用RT-qPCR檢測信號通路中關鍵基因（PI3K、AKT、HO-1）的表達。同時，對M1巨噬細胞標志蛋白CD86以及M2巨噬細胞標志蛋白CD206進行免疫熒光染色，表征在電活性神經(jīng)導管介導下?lián)p傷部位的炎癥環(huán)境。結果表明，在電活性神經(jīng)導管的介導下，PI3K、AKT和HO-1均顯著上調（圖8A），且CD206與CD86的免疫熒光染色結果與RT-qPCR的結果保持一致，表明電活性神經(jīng)導管在體內仍然具有促進巨噬細胞向M2抗炎表型極化的效果（圖8C）。同時，為了反向驗證信號通路的準確性，在動物實驗中，設置了LY294002+導管組，對該組別的大鼠進行隔日腹腔注射PI3K抑制劑LY294002的處理，持續(xù)一月。發(fā)現(xiàn)該組別顯示出了較為顯著的炎癥反應，與純導管組的結果相反，進一步確定了雙重電活性神經(jīng)導管是通過激活PI3K/AKT信號通路達到的抗炎效果（圖8B）。
圖9. 雙重電活性神經(jīng)導管通過調節(jié)免疫微環(huán)境間接促進周圍神經(jīng)修復
體外細胞實驗已經(jīng)證明了在電活性材介導下巨噬細胞會分泌相關活性因子，從而影響雪旺細胞，間接促進周圍神經(jīng)修復，本研究在體內動物實驗也進一步論證了這一論點。采用RT-qPCR實驗檢測與神經(jīng)修復相關蛋白（NGF、BDNF、NCAM）的表達，結果表明其表達與抗炎相關蛋白的表達趨勢相同，并且在具有PI3K抑制劑LY294002的組別中，NGF、BDNF的表達顯著下降且NCAM升高（圖9A）。為了更加直觀和全面的分析本研究中所有RT-qPCR基因檢測結果，將所有組別在兩個時間節(jié)點（第1周，第4周）上涉及到的所有基因表達水平進行了聚類熱圖分析（圖9B）。導管組組不管是在哪個時間節(jié)點，都能激活PI3K/AKT信號通路，促進HO-1的表達來調節(jié)炎癥環(huán)境，并上調抗炎因子的表達而抑制促炎因子的表達，最終促進周圍神經(jīng)修復。
圖10. 電活性材料對免疫微環(huán)境的調節(jié)對受損坐骨神經(jīng)的修復具有重要意義
為了驗證炎癥信號通路的阻斷是否最終會影響其運動功能的恢復，在動物實驗中，本工作還設置了導管+LY294002組。結果顯示，不同組對腓腸肌萎縮的抑制程度如下：空白組<導管+LY294002組<導管組（圖10A-B），表明雖然電活性神經(jīng)導管可顯著抑制腓腸肌萎縮，但當炎癥信號通路被阻斷時，電活性神經(jīng)導管對腓腸肌的抑制作用大大減弱。此外，還對再生神經(jīng)的縱切面進行了H&E染色（圖10C），發(fā)現(xiàn)導管組在第28天實現(xiàn)了橫斷神經(jīng)的完全連接，而導管+LY294002組尚未實現(xiàn)損傷神經(jīng)的遠端與近端連接。SFI運動功能指數(shù)的測試結果（圖10D），甲苯胺藍染色（圖10E）和透射電鏡觀察再生神經(jīng)的軸突形成和髓鞘再生結果（圖10F）以及CD31免疫組化染色結果（圖10G）都顯示導管組具有較好的促坐骨神經(jīng)再生的作用。然而，當PI3K/AKT-Nrf2信號通路被阻斷時，其修復效果大打折扣，并且隨著時間的延長，這種現(xiàn)象變得更加突出。從上述結果不難得出，免疫微環(huán)境的調節(jié)對周圍神經(jīng)的修復至關重要，當免疫微環(huán)境調控途徑被阻斷時，其促進神經(jīng)修復的作用大大減弱。
本研究證明了電活性材料在調節(jié)免疫微環(huán)境和周圍神經(jīng)修復中的有效性，同時突出了免疫調節(jié)在周圍神經(jīng)修復中的關鍵作用，為電活性人工神經(jīng)導管應用于臨床周圍神經(jīng)修復提供了理論依據(jù)。
該研究工作得到了國家自然科學基金（31971261、52272276、52073103）、廣東省基礎與應用基礎研究基金（2023A1515012232、2020A1515010668）等經(jīng)費資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202400217
