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第一作者：陳思親，鐘寅，范武發(fā)，相佳佳

通訊作者：申有青 教授

第一單位：浙江大學(xué)

DOI：10.1038/s41551-021-00701-4

  在國(guó)家自然科學(xué)基金(51833008)和浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2020C01123)的資助下，浙江大學(xué)申有青教授團(tuán)隊(duì)在主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞型高效抗腫瘤納米藥物的研究領(lǐng)域再次取得新的進(jìn)展。繼2019年提出了酶響應(yīng)型納米藥物的腫瘤主動(dòng)滲透新機(jī)制以來(lái)(Nature Nanotechnology)，該團(tuán)隊(duì)成員持續(xù)致力于開(kāi)發(fā)具有高效主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞作用的藥物遞送體系，并進(jìn)一步提出了一種簡(jiǎn)化藥物載體結(jié)構(gòu)的策略：即利用能夠弱黏附細(xì)胞膜、但不黏附蛋白質(zhì)的兩性離子聚合物為載體，使之同時(shí)具備血液長(zhǎng)循環(huán)性能和不必發(fā)生酶催化反應(yīng)就觸發(fā)腫瘤細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞的特性。這一策略不但極大地簡(jiǎn)化了納米藥物的結(jié)構(gòu)，而且能夠更加高效地外滲進(jìn)入腫瘤組織并滲透擴(kuò)散，將藥物遞送到瘤內(nèi)所有細(xì)胞，獲得極高的療效，因此具備良好的臨床轉(zhuǎn)化潛力。相關(guān)研究成果以“Enhanced tumour penetration and prolonged circulation in blood of polyzwitterion–drug conjugates with cell-membrane affinity”為題，于2021年4月15日在線發(fā)表于國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Biomedical Engineering雜志上，申有青教授為通訊作者，浙江大學(xué)為第一單位。

  近年來(lái)，納米藥物的臨床應(yīng)用取得了重大進(jìn)展，其中一些納米藥物已經(jīng)在臨床上應(yīng)用或處于臨床試驗(yàn)階段，但是幾乎所有的納米藥物都未能達(dá)到預(yù)期的臨床治療效果。在腫瘤靶向的納米藥物遞送過(guò)程中，納米粒子必須經(jīng)歷血液長(zhǎng)循環(huán)（Circulation）、腫瘤蓄積（Accumulation）、腫瘤浸潤(rùn)（Penetration）、腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞（Internalization）和藥物釋放（drug Release）這五步級(jí)聯(lián)反應(yīng)（CAPIR Cascade）才能有效地將藥物遞送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)^[1-2]。EPR效應(yīng)被公認(rèn)為是納米藥物在腫瘤部位富集的主要因素，但是EPR效應(yīng)在臨床腫瘤中的發(fā)生率低且具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，導(dǎo)致基于EPR效應(yīng)的納米藥物難以從血管進(jìn)入腫瘤組織；同時(shí)，納米藥物固有的大尺寸（相對(duì)于小分子藥物）和腫瘤微環(huán)境的致密性，使得納米藥物更加難以在實(shí)體腫瘤內(nèi)滲透，導(dǎo)致無(wú)法將藥物遞送至遠(yuǎn)離血管的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮治療作用。因此，腫瘤血管外滲困難和腫瘤組織滲透困難仍然是傳統(tǒng)納米藥物難以克服的瓶頸。為了克服藥物輸送過(guò)程中的各種生理屏障，國(guó)內(nèi)外研究人員設(shè)計(jì)了各種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多功能納米藥物，但未能從根本上解決納米藥物依賴于EPR外滲和在瘤內(nèi)被動(dòng)擴(kuò)散困境，其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性也不可避免地增加了臨床轉(zhuǎn)化的困難。

  本團(tuán)隊(duì)在前期工作中首次提出：基于主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞的納米藥物設(shè)計(jì)策略能夠巧妙地利用腫瘤內(nèi)細(xì)胞密度高的特點(diǎn)，讓腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞“主動(dòng)地”在細(xì)胞間傳遞納米藥物，從而有效地外滲進(jìn)入腫瘤組織并克服腫瘤微環(huán)境對(duì)納米粒子被動(dòng)擴(kuò)散的障礙，打破了納米藥物遞送過(guò)程中面臨的外滲難和浸潤(rùn)難的瓶頸。但是，前期設(shè)計(jì)的主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞納米藥物需要先在腫瘤部位發(fā)生酶催化產(chǎn)生胺的反應(yīng)才能觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞作用^[3-4]，其載體結(jié)構(gòu)相對(duì)比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步簡(jiǎn)化載體結(jié)構(gòu)和提高遞送效率。

本文亮點(diǎn)

  在本項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)合成了一種含有三級(jí)胺氮氧結(jié)構(gòu)的兩性離子聚合物OPDEA，它具有不與蛋白質(zhì)吸附卻能與細(xì)胞膜可逆吸附的特性，因此能夠“隱蔽”在血液循環(huán)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)和腫瘤富集；另一方面，它能快速被腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞攝取，從而觸發(fā)主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞作用并實(shí)現(xiàn)高效的腫瘤血管外滲和腫瘤主動(dòng)滲透。基于此，研究人員利用OPDEA攜載化療藥物7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿（SN38）制備了以O(shè)PDEA為親水外層、以SN38前藥聚合物為疏水內(nèi)核的腫瘤主動(dòng)滲透型納米載藥膠束（OPDEA-PSN38）（圖1a）。尾靜脈注射后，該膠束能可逆地吸附到紅細(xì)胞上而不吸附血漿蛋白，具有較好的血液長(zhǎng)循環(huán)；一旦到達(dá)腫瘤部位，它能弱吸附在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上并觸發(fā)其轉(zhuǎn)胞吞作用，快速外滲至腫瘤組織中，進(jìn)而通過(guò)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞作用實(shí)現(xiàn)高效的腫瘤滲透，能夠浸潤(rùn)到乏血管、缺氧甚至壞死區(qū)域，從而將藥物遞送到所有細(xì)胞，最終徹底消滅腫瘤組織中所有的腫瘤細(xì)胞（圖1b）。與臨床一線化療藥物伊立替康（CPT-11）及其脂質(zhì)體相比，該納米藥物在多種荷瘤小鼠模型（包括肝癌原位模型和人源腫瘤異種移植瘤模型）中均表現(xiàn)出優(yōu)異的抑瘤作用，在常規(guī)給藥劑量下，它不僅能清除起始腫瘤大小為70 mm³的小腫瘤，也能清除起始腫瘤大小為500 mm³的大腫瘤，而且生物安全性良好，不會(huì)產(chǎn)生停藥反彈等副作用（圖1, c-f）。

圖1 OPDEA-PSN38膠束的腫瘤主動(dòng)滲透機(jī)理示意圖和抑瘤曲線。（a）OPDEA-PSN38膠束的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（b）OPDEA-PSN38在腫瘤部位的轉(zhuǎn)胞吞作用和腫瘤滲透機(jī)理：i）膠束能可逆吸附在紅細(xì)胞上進(jìn)行血液長(zhǎng)循環(huán)，ii）通過(guò)EPR效應(yīng)在被動(dòng)擴(kuò)散至腫瘤組織，iii）通過(guò)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的主動(dòng)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)/轉(zhuǎn)胞吞作用在腫瘤組織蓄積，iv) 在腫瘤組織中基于轉(zhuǎn)胞吞作用實(shí)現(xiàn)主動(dòng)滲透。（c-d）OPDEA-PSN38膠束在肝癌皮下小腫瘤模型（c，初始腫瘤體積~70 mm³）和大腫瘤模型（d，初始腫瘤體積~500 mm³）中均表現(xiàn)出根治性的治療效果；（e）在肝癌原位腫瘤模型中，OPDEA-PSN38膠束治療組的小鼠腫瘤被徹底清除；（f）在肝癌PDX模型中，OPDEA-PSN38膠束的抑瘤作用顯著優(yōu)于同等治療劑量和更高治療劑量的臨床一線藥物（CPT-11）治療組。

圖2  OPDEA能夠弱黏附細(xì)胞膜，因此不需要發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變就能同時(shí)具備血液長(zhǎng)循環(huán)性能和被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞的能力。（a）等離子共振實(shí)驗(yàn)證明OPDEA與細(xì)胞膜磷脂具有較強(qiáng)的分子間相互作用力；（b）分子模擬實(shí)驗(yàn)證明OPDEA與磷脂能形成較強(qiáng)的氫鍵相互作用；（c）紅細(xì)胞吸附-洗脫實(shí)驗(yàn)證明OPDEA能在紅細(xì)胞上可逆吸附，有利于實(shí)現(xiàn)血液長(zhǎng)循環(huán)和腫瘤富集；（d）血漿清除實(shí)驗(yàn)證明OPDEA的血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)；（e）小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)證明OPDEA具有良好的腫瘤靶向富集作用；（f）腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)證明OPDEA能快速被細(xì)胞攝取，有利于觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞作用。

圖3 OPDEA能觸發(fā)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞作用，從而快速外滲進(jìn)入腫瘤組織并徹底滲透。（a-b）Transwell實(shí)驗(yàn)證明OPDEA（a）或OPDEA-PSN38膠束（b）能觸發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞作用。其中，癌化的內(nèi)皮細(xì)胞（ECDHCC-1）具有比正常內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）更高效的轉(zhuǎn)胞吞作用；血液流速會(huì)降低轉(zhuǎn)胞吞速率。（c-d）透射電鏡圖像證明OPDEA-PSN38膠束能觸發(fā)ECDHCC-1細(xì)胞（a）和實(shí)體腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞（b）的轉(zhuǎn)胞吞作用，因此內(nèi)皮細(xì)胞中具有大量轉(zhuǎn)胞吞囊泡（紅色星號(hào)）、細(xì)胞突觸（藍(lán)色箭頭）和內(nèi)皮細(xì)胞膜的窗孔結(jié)構(gòu)（紅色箭頭）；（e）激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)成像證明尾靜脈注射的OPDEA能夠快速發(fā)生血管外滲并充分浸潤(rùn)到腫瘤組織內(nèi)部。

圖4  OPDEA-PSN38膠束能通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)胞吞作用快速浸潤(rùn)到腫瘤組織中的乏血管、缺氧甚至壞死區(qū)域。（a）跨細(xì)胞傳遞實(shí)驗(yàn)證明OPDEA在腫瘤細(xì)胞中能通過(guò)不斷的“內(nèi)吞-外排”作用實(shí)現(xiàn)快速的轉(zhuǎn)胞吞作用；（b）光聲成像實(shí)驗(yàn)證明OPDEA-PSN38膠束能滲透到實(shí)體腫瘤的乏血管區(qū)域；（c）免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證明OPDEA-PSN38膠束能滲透到實(shí)體腫瘤的缺氧區(qū)域和壞死區(qū)域。

  綜上所述， N-O結(jié)構(gòu)具有的弱黏附細(xì)胞膜、但不黏附蛋白質(zhì)的特性，賦予了納米藥物CAPI所需的所有功能，即血液長(zhǎng)循環(huán)、不依賴于傳統(tǒng)被動(dòng)蓄積機(jī)制（EPR效應(yīng)）的腫瘤血管主動(dòng)外滲、高效瘤內(nèi)滲透和快速細(xì)胞內(nèi)吞，納米藥物療效高且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。與將多種功能組分組裝獲得多功能納米藥物（All functional components-into-One）的方法相比，這種單一結(jié)構(gòu)賦予多種所需功能（One-for-all functions）來(lái)簡(jiǎn)化納米藥物結(jié)構(gòu)的方法，為臨床轉(zhuǎn)化納米藥物的設(shè)計(jì)提供了新的思路。目前此項(xiàng)專利技術(shù)已轉(zhuǎn)讓海南普利制藥股份有限公司進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化。

  參考文獻(xiàn)

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  論文鏈接：

  https://dx.doi.org/10.1038/s41551-021-00701-4

  https://www.nature.com/articles/s41565-019-0485-z