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  急性肺損傷（ALI）是一種以肺泡-毛細(xì)血管屏障破壞、失控性炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激級聯(lián)為特征的危重癥，常由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷或膿毒癥引發(fā)。其病理進(jìn)程始于病原體或損傷信號激活肺泡巨噬細(xì)胞，觸發(fā)促炎因子（如TNF-α、IL-1β）的爆發(fā)性釋放，募集中性粒細(xì)胞浸潤肺組織并產(chǎn)生過量活性氧（ROS）。這些過程形成“炎癥-氧化應(yīng)激”的惡性循環(huán)，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡、肺水腫及進(jìn)行性呼吸衰竭。傳統(tǒng)治療依賴糖皮質(zhì)激素抑制炎癥，但長期使用易引發(fā)免疫抑制與繼發(fā)感染；機(jī)械通氣雖可維持氧合，卻可能因氣壓加重肺組織損傷。與此同時(shí)，天然抗炎抗氧化劑如花旗松素（Tax）雖能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化、清除ROS及抑制NF-κB通路發(fā)揮治療潛力，卻因水溶性差、體內(nèi)代謝快及缺乏靶向性，難以在病灶部位達(dá)到有效濃度，極大限制了其臨床應(yīng)用。

  聚酰胺-胺樹狀大分子（PAMAM）表面具有豐富的氨基基團(tuán)、且具有高度支化的三維立體結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的單分散性。納米凝膠（NGs）是由親水性或兩親性的高分子通過物理或化學(xué)交聯(lián)的方式組成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的納米尺度水凝膠顆粒，具有良好的膠體穩(wěn)定性、生物相容性、高負(fù)載能力、易被細(xì)胞吞噬等優(yōu)勢。另外，NGs可以通過在單體表面修飾金屬離子、內(nèi)部載藥或?qū)宦?lián)劑進(jìn)行設(shè)計(jì)從而改善藥物遞送效率、賦予材料環(huán)境響應(yīng)性和更好的抗腫瘤效果。因此，使用PAMAM樹狀大分子為原材料制備納米凝膠，有望結(jié)合樹狀大分子和納米凝膠的雙重優(yōu)勢，為構(gòu)建具有響應(yīng)性的藥物遞送載體提供新思路。

  另外，間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體（MSC-Exos）因其獨(dú)特的生物學(xué)特性成為研究焦點(diǎn)。MSC-Exos可通過下調(diào)NF-κB信號通路抑制炎癥風(fēng)暴，并通過趨炎特性與肺泡巨噬細(xì)胞特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向遞送。如何將MSC-Exos的先天優(yōu)勢與智能納米載體的可控釋放特性相結(jié)合，成為突破ALI治療瓶頸的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

  基于此，東華大學(xué)史向陽教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種外泌體修飾的ROS響應(yīng)型納米凝膠系統(tǒng)（MSC@DT-NGs）。該系統(tǒng)以第三代聚酰胺-胺樹狀大分子（G3.NH?）為核心骨架，通過多級設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)功能協(xié)同：利用苯硼酸酯鍵在G3.NH₂上共價(jià)負(fù)載Tax，再與含有雙硒鍵（SeSe）的交聯(lián)劑合成納米凝膠，賦予納米凝膠酸和活性氧雙響應(yīng)性。最后，通過超聲-擠出技術(shù)將MSC-Exos包裹于凝膠表面，利用其表面α₄β₁整合素特異性靶向肺泡巨噬細(xì)胞。此外，MSC-Exos內(nèi)源性抗炎成分與Tax形成協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，阻斷炎癥信號傳導(dǎo)（圖1）。這種多級遞送系統(tǒng)有效降低了肺部炎癥因子水平，顯著修復(fù)了脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI所產(chǎn)生的肺損傷，為ALI提供了精準(zhǔn)靶向、長效緩釋與多機(jī)制協(xié)同的綜合治療方案。

圖1、MSC@DT-NGs的制備及其在ALI中的治療機(jī)制示意圖。

  研究團(tuán)隊(duì)通過核磁共振氫譜（1H NMR）驗(yàn)證了Tax在樹狀大分子表面的成功修飾（每個(gè)樹狀大分子約負(fù)載2.8個(gè)Tax分子），透射電鏡（TEM）與原子力顯微鏡（AFM）顯示DT-NGs呈均勻球形，證明了納米凝膠DT-NGs的成功合成（圖2A-C）。TEM圖像表明了MSC-Exos的成功提取，且經(jīng)納米顆粒追蹤分析（NTA）確認(rèn)其平均粒徑為101.7 nm，并高表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白TSG101和CD63（圖2D-E）。通過優(yōu)化質(zhì)量比（MSC-Exos:DT-NGs = 0.2: 1），最終獲得的MSC@DT-NGs粒徑縮小至78.3 nm，表面電位由+11.1 mV降至-5.2 mV，顯著降低了載藥后的陽離子樹狀大分子的潛在細(xì)胞毒性（圖2F-G）。TEM圖像表明MSC@DT-NGs具有均一的尺寸，且MSC-Exo完整的包裹在了DT-NGs外部，在MSC-Exos的擠壓作用下MSC@DT-NGs的粒徑減小至50.2 nm（圖2H-I）。體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，MSC@DT-NGs在水、PBS及DMEM培養(yǎng)基中可至少保持7天尺寸穩(wěn)定（圖2J）。當(dāng)MSC@DT-NGs分散在有無過氧化氫的pH 6.5或有過氧化氫且pH為7.4的PBS緩沖液中，1小時(shí)后，MSC@DT-NGs在各組溶液中均表現(xiàn)出多個(gè)粒度分布峰，且藥物釋放實(shí)驗(yàn)證明MSC@DT-NGs在pH 6.5且存在過氧化氫的條件下表現(xiàn)出最理想的藥物釋放性能，表明MSC@DT-NGs納米凝膠系統(tǒng)具有微環(huán)境響應(yīng)型藥物釋放的特性，可以精準(zhǔn)的進(jìn)行治療藥物的遞送，從而獲得更好的療效，并將副作用降至最低（圖2K-L）。

圖2、（A）G3-PBA和G3-Tax樹狀大分子的核磁共振氫譜（¹H NMR）。（B）DT-NGs的TEM和（C）AFM圖像。（D）MSC-Exos的TEM圖像。（E）Western Blot（WB）分析間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、MSC-Exos和MSC@DT-NGs中CD63、TSG101和Calnexin的表達(dá)。（F）G3-Tax、DT-NGs、MSC-Exos和MSC@DT-NGs的流體力學(xué)尺寸/PDI和（G）Zeta電位。（H）MSC@DT-NGs的TEM圖像和（I）尺寸分布直方圖。（J）MSC@DT-NGs分別在水、PBS和DMEM中分散一周的流體力學(xué)尺寸變化。（K）MSC@DT-NGs在不同介質(zhì)中的流體力學(xué)尺寸分布。（L）用紫外-可見光譜法測量不同條件下MSC@DT-NGs中Tax的釋放情況。

  研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)MSC@DT-NGs在100 μM的濃度內(nèi)具有較好的細(xì)胞相容性（圖3A）。MSC@DT-NGs納米凝膠系統(tǒng)通過MSC-Exos介導(dǎo)的內(nèi)吞作用靶向MH-S細(xì)胞（圖3B-E），其細(xì)胞攝取效率較單獨(dú)的DT-NGs顯著提升。由于Tax和MSC-Exos的協(xié)同抗氧化以及MSC-Exos趨炎靶向的作用，流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡結(jié)果共同顯示了MSC@DT-NGs治療組具有優(yōu)異的ROS清除效果（圖3F-H）。

圖3、（A）不同濃度Tax、DT-NGs及MSC@DT-NGs處理MH-S細(xì)胞24小時(shí)的活力。（B）PBS、Cy5.5-DT-NGs或MSC@Cy5.5-DT-NGs處理MH-S細(xì)胞4小時(shí)后的流式細(xì)胞儀分析和（C）CLSM圖像。（D）MSC@Cy5.5-DT-NGs處理MH-S細(xì)胞4小時(shí)后的代表性流式細(xì)胞儀圖及（E）相應(yīng)熒光強(qiáng)度定量結(jié)果。MH-S細(xì)胞在MSC@Cy5.5-DT-NGs培養(yǎng)前用不同的內(nèi)吞抑制劑預(yù)處理2小時(shí)。（F-G）檢測與Tax、DT-NGs或MSC@DT-NGs培養(yǎng)24小時(shí)后LPS激活的MH-S細(xì)胞中的ROS含量及（H）相應(yīng)的CLSM圖像。

  研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)MSC@DT-NGs通過遞送Tax并協(xié)同SeSe和MSC-Exos的抗炎抗氧化效果，顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞由促炎M1表型（CD86+細(xì)胞占比降至22.4%）向抗炎M2表型極化（CD206+細(xì)胞占比提升至23.3%），并顯著降低CD 16/32的表達(dá)同時(shí)促進(jìn)CD206的表達(dá)（圖4A-D）。該納米凝膠系統(tǒng)可同步抑制促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，并上調(diào)抗炎因子IL-10水平（圖4E-H）。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了MSC@DT-NGs可顯著抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，從而阻斷炎癥信號通路（圖4I）。

圖4、（A）流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理后LPS激活的MH-S細(xì)胞中CD86和CD206的表達(dá)水平。不同處理后（B）CD86陽性巨噬細(xì)胞（M1）和（C）CD206陽性巨噬細(xì)胞（M2）的百分比。（D）不同處理后，LPS激活的MH-S細(xì)胞中CD16/32和CD206的免疫熒光染色。（I）WB分析不同處理24 h后LPS激活的MH-S細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)水平。

  研究團(tuán)隊(duì)通過構(gòu)建ALI小鼠模型驗(yàn)證MSC@DT-NGs納米凝膠系統(tǒng)的體內(nèi)療效（圖5A）。Micro-CT三維成像直觀顯示出MSC@DT-NGs組肺組織表面光滑、結(jié)構(gòu)完整，與嚴(yán)重?fù)p傷的LPS組形成鮮明對比（圖5B）。此外，MSC@DT-NGs組肺濕/干重比顯著低于LPS陽性對照組，表明其有效緩解肺水腫（圖5C）。H&E染色顯示，MSC@DT-NGs的治療使肺泡壁充血與炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，肺損傷評分接近正常對照組（圖5D-E）。

圖5、（A）ALI小鼠體內(nèi)抗炎治療示意圖。（B）不同治療后ALI小鼠肺組織的Micro-CT圖像。（C）不同治療后ALI小鼠的肺組織濕/干重量比。（D）不同干預(yù)措施后ALI小鼠肺組織的H&E染色結(jié)果。（E）不同組別ALI小鼠的肺損傷評分。

  肺組織的ROS冷凍切片染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，MSC@DT-NGs治療組肺組織的活性氧水平較LPS組顯著下降（圖6A）。免疫熒光分析顯示，MSC@DT-NGs組肺組織中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg-1熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，同時(shí)M1型標(biāo)記iNOS信號降低77.8%，表明其通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化重塑抗炎微環(huán)境（圖6B）。MSC@DT-NGs可以顯著降低支氣管肺泡灌洗液（BALF）中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平（降幅 > 50%），并顯著提高了抗炎因子IL-10表達(dá)（圖6C-F）。此外，MSC@DT-NGs使肺組織內(nèi)MPO的水平較LPS組降低了60%（圖6G）。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析證實(shí)，MSC@DT-NGs使肺組織中性粒細(xì)胞浸潤比例從LPS組的39.6%降至26.1%（圖6H-I），提示其通過抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)減少中性粒細(xì)胞募集。以上數(shù)據(jù)表明，MSC@DT-NGs納米凝膠系統(tǒng)通過高效遞送Tax并協(xié)同MSC-Exos和SeSe的抗炎抗氧化效果，調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞的促炎/抗炎平衡，有效緩解了ALI病理過程中的炎癥-氧化應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)，從而達(dá)到更好的治療效果。

圖6、（A）不同處理后ALI小鼠肺組織的ROS染色。（B）不同處理后ALI小鼠肺組織巨噬細(xì)胞極化的免疫熒光染色。（C-F）不同處理后ALI小鼠肺泡灌洗液（BALF）中促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平。（G）不同處理后ALI小鼠BALF中中性粒細(xì)胞生物標(biāo)志物MPO的表達(dá)水平。（H）ALI小鼠經(jīng)不同材料處理24 小時(shí)后肺組織中中性粒細(xì)胞的百分比。（I）ALI小鼠經(jīng)不同處理后肺組織中中性粒細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞分析結(jié)果。

  簡而言之，本研究開發(fā)了一種外泌體包裹的載藥納米凝膠（MSC@DT-NGs），用于ALI的高效治療。該納米凝膠系統(tǒng)以G3.NH?為核心骨架，利用苯硼酸酯鍵共價(jià)負(fù)載Tax，再與含有SeSe的交聯(lián)劑合成納米凝膠，進(jìn)一步通過超聲-擠出技術(shù)將MSC-Exos包裹于凝膠表面。通過系統(tǒng)表征MSC@DT-NGs納米凝膠系統(tǒng)的粒徑形貌、穩(wěn)定性、環(huán)境響應(yīng)性及藥物釋放性能，證實(shí)了其結(jié)構(gòu)的完整性。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該納米凝膠系統(tǒng)在清除ROS、促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化及調(diào)控炎癥因子等方面的抗炎抗氧化活性。進(jìn)一步通過ALI小鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估其治療效果。MSC@DT-NGs的優(yōu)勢主要源于以下三點(diǎn)：（1）ROS響應(yīng)型納米凝膠可以實(shí)現(xiàn)Tax在炎癥部位的精準(zhǔn)釋放；（2）MSC-Exos賦予納米凝膠系統(tǒng)靶向肺泡巨噬細(xì)胞的能力，并增強(qiáng)其對于肺泡巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控；（3）SeSe與Tax協(xié)同清除ROS，并在MSC-Exos的協(xié)同作用下抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，從而實(shí)現(xiàn)良好的抗炎抗氧化效果。該研究為炎癥性疾病的聯(lián)合治療提供了創(chuàng)新策略，未來有望拓展至其他免疫失衡相關(guān)疾病的干預(yù)。

  以上研究成果以“Exosome-Coated Responsive Dendrimer Nanogels Enable Combined Immunomodulation and Antioxidant Treatment of Acute Lung Injury”為題，在線發(fā)表于國際著名期刊Science China-Chemistry (DOI: 10.1007/s11426-025-2737-5)。東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院史向陽教授和沈明武研究員為共同通訊作者，東華大學(xué)碩士生李晶晶為第一作者。該工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金、上海市科委等項(xiàng)目的資助。

  文章鏈接：https://www.sciengine.com/SCC/doi/10.1007/s11426-025-2737-5